Wnt2b对肝纤维化进程影响及机制研究

发布时间：2018-11-25 22:41

【摘要】：研究背景肝纤维化是肝组织内细胞外基质(extracellular matrix, ECM)过度沉积而导致肝脏结构与功能异常改变的病理变化,是各种慢性肝病进展为肝硬化、肝癌的共有基础和必经途径。就本质而言,肝纤维化是肝脏对各种致病因素造成慢性肝损伤的一种代偿性修复反应。现有研究证实,肝纤维化在一定程度上可以逆转,即通过及时终止损伤因素的刺激并进行抗纤维化治疗,可有效延缓甚至逆转疾病进程,继而阻断“慢性肝病-肝纤维化-肝硬化-肝癌”的演变过程。遗憾的是,到目前为止,临床仍旧缺乏安全有效、特异性针对肝纤维化的治疗措施。因此,重视肝纤维化的基础研究与临床治疗,对于改善慢性肝病患者预后,以及降低肝硬化、肝功能衰竭、肝癌等相关致死率具有重要的理论与实际意义。肝纤维化的发病机制复杂。既往研究表明,肝内多种细胞参与肝纤维化的形成过程,其中肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)的激活和表型转化被认为是纤维化进程中的中心环节与关键事件。当肝脏受损时,在肝内多种因素刺激下,HSCs由富含维生素的静息状态活化为具有增殖、收缩、促炎及促纤维化能力的肌成纤维细胞,在肝脏损伤部位移行,合成并分泌大量富含胶原的ECM,招募更多炎性细胞至受损部位,进而造成肝脏结构与功能异常,发生纤维样病变。研究表明,上述过程受到多种基因与信号通路的调节。其中Wnt(Wingless-type MMTV integration site)信号通路与疾病进展密切相关。但是,Wnt家族成员复杂,其作用和机制不尽相同,在HSCs活化和肝纤维化进程中的具体机制尚未完全阐明。Wnt2b分子是第13个被克隆出的Wnt基因,在人、小鼠、鸡和斑马鱼上都高度保守,对于器官生成与组织修复具有重要的生理意义。研究发现Wnt2b分子对于胚胎时期肝脏生成是必需的,Wnt2b分子的缺失将导致肝脏发育不全,对肝脏再生等过程亦发挥重要作用;此外,Shackel等人通过cDNA微阵列分析发现,Wnt2b在人原发性胆汁性肝硬化(Primary Biliary Cirrhosis,PBC)肝组织中呈现基因水平上调趋势。然而,关于Wnt2b在纤维化相关肝脏疾病中发挥的具体作用及机制尚无研究报道。因此,我们拟利用分子生物学、细胞生物学等技术,通过体内外实验模型探讨Wnt2b在HSCs活化及肝纤维化形成过程中的作用及机制。研究目的1.观察Wnt2b在临床纤维化相关肝病患者及肝纤维化模型小鼠肝组织中的表达水平变化,鉴定Wnt2b的主要细胞来源;2.分析肝内Wnt2b表达水平对肝纤维化疾病进程及HSCs活化程度的影响;3.阐明Wnt2b调控纤维化进程及HSCs活化的分子机制。研究方法1.应用免疫组织化学方法对临床纤维化相关肝病患者及健康对照肝组织芯片中Wnt2b的表达情况进行检测;2.分别应用硫代乙酰胺(TAA)、四氯化碳(CC14)腹腔注射法建立小鼠肝纤维化模型;3.应用体外CCl4饱和溶液刺激法建立体外肝实质细胞受损模型;4.应用免疫组织化学法、Western blotting及PCR法检测肝组织中Wnt2b蛋白与基因水平;5.应用ELISA法检测小鼠肝组织匀浆中Wnt2b表达水平;6.应用冰冻切片免疫荧光双染法检测Wnt2b在小鼠肝组织中的表达与定位;7.应用肝脏原位灌流及密度梯度法分离并比较Wnt2b在小鼠肝实质细胞及非肝实质细胞中表达水平;8.应用肝脏原位灌流及密度梯度法分离鉴定小鼠HSCs,检测Wnt2b在纤维化小鼠HSCs中的表达水平;9.分离野生型C57BL/6小鼠原代HSCs,检测体外培养自活化过程中Wnt2b表达水平;10.通过尾静脉高压注射的方式,将Wnt2b沉默/过表达质粒导入肝脏,Western blotting检测肝组织中Wnt2b蛋白水平以评价所用质粒效率;11.将TAA造模小鼠随机分为四组,即sh-对照载体组与Sh-Wnt2b组,Over-对照载体组与Over-Wnt2b组,评价沉默/过表达肝内Wnt2b水平对纤维化进程影响:应用HE、天狼猩红染色法、Western blotting、免疫荧光法、流式细胞术、ALT法等检测干预肝内Wnt2b水平对TAA造模小鼠肝脏胶原沉积、HSCs活化、炎性细胞浸润及肝细胞损伤程度的影响,以评价沉默/过表达肝内Wnt2b水平对纤维化进程的可能调控作用。12.肝脏原位灌流及Opti-Prep密度梯度离心分离野生型C57BL/6小鼠HSCs,体外培养1天(静息期)及14天(活化期),提取RNA,应用PCR法检测HSCs Wnt相关受体表达情况,并比较静息期与活化期受体水平变化;13.采取Wnt2b条件培养基孵育HSCs及瞬时转染Wnt2b过表达质粒两种方式,模拟纤维化进程中旁分泌/HSCs自分泌来源的Wnt2b,并应用PCR及Western blotting法检测Wnt2b对HSCs中α-SMA、Ⅰ型胶原基因及蛋白水平影响;14.应用免疫组织化学法、PCR及Western blotting法检测肝组织中β-Catenin蛋白与基因水平;15.应用肝脏原位灌流及密度梯度法分离小鼠HSCs,检测纤维化小鼠HSCs中β-Catenin的表达水平;16.分离野生型C57BL/6小鼠原代HSCs,检测体外培养自活化过程中β-Catenin表达水平;17.采取Wnt2b条件培养基孵育HSCs及瞬时转染Wnt2b过表达质粒两种方式,模拟纤维化进程中旁分泌/HSCs自分泌来源的Wnt2b,应用Western blotting法检测Wnt2b对HSCs中β-Catenin表达水平影响;18.在Wnt2b作用过程中,引入β-Catenin干扰质粒,检测沉默β-Catenin是否影响Wnt2b对LX2细胞α-SMA及Ⅰ型胶原的抑制效应;19.应用免疫组织化学法、PCR及Western blotting法检测肝组织中TLR4表达水平;20.应用肝脏原位灌流及密度梯度法分离小鼠HSCs,检测纤维化小鼠HSCs中TLR4表达水平;21.应用TLR4抑制剂阻断TLR4信号通路,然后以Western blotting、天狼猩红染色法检测并评价沉默肝内Wnt2b而引起的HSCs活化、胶原沉积等效应是否是TLR4信号通路依赖的;22. Western blotting法检测Wnt2b对LPS促进LX2细胞α-SMA及Ⅰ型胶原表达效应的可能影响,以及对LPS增敏TGF-β促LX2细胞活化效应的影响;23. PCR及Western blotting法检测体外Wnt2b作用的LX2细胞以及体内高压注射Wnt2b过表达/沉默质粒小鼠肝组织TLR4通路相关分子表达情况;24.肝脏原位灌流分离小鼠HSCs,免疫荧光法评价沉默/过表达肝内Wnt2b水平对纤维化小鼠HSCs胞内NF-κB表达及核转位的影响。研究结果1. Wnt2b在人及小鼠纤维化肝脏中表达升高与健康对照组相比,临床纤维化相关肝病患者肝组织中Wnt2b表达水平显著升高。与临床样本检测结果一致,TAA及CC14两种纤维化模型诱导小鼠肝组织中均呈现Wnt2b表达水平升高现象。这一现象提示,Wnt2b可能参与调控肝纤维化疾病进程。2.肝实质细胞是纤维化肝脏中表达Wnt2b的主要来源免疫荧光双染法结果提示,Wnt2b主要定位在小鼠肝实质细胞上。肝脏原位灌流法分离小鼠肝实质细胞及非肝实质细胞,结果显示,在纤维化小鼠肝实质细胞中Wnt2b蛋白及基因水平均呈现明显升高趋势,而在非肝实质细胞中Wnt2b略有上调;体外实验亦证明,当原代肝实质细胞受到化学毒物刺激时,其Wnt2b基因及蛋白水平均可发生明显上调。肝脏原位灌流法分离小鼠HSCs,结果显示,从纤维化肝脏分离的HSCs其Wnt2b表达水平高于正常对照组;而体外结果证明在HSCs自活化过程中亦伴随着Wnt2b表达水平升高现象,提示作为非肝实质细胞中的重要组成部分,活化型HSCs也可一定程度上调Wnt2b,但其对于纤维化肝内Wnt2b总体水平贡献程度低于肝实质细胞。以上结果表明,肝实质细胞是纤维化肝脏中表达Wnt2b的主要来源。3. Wnt2b具有抗纤维化发展作用通过尾静脉高压注射的方式,将Wnt2b沉默/过表达质粒导入纤维化造模小鼠肝脏,Western blotting结果显示,与对照组相比,注射Wnt2b沉默质粒组小鼠肝组织Wnt2b水平降低,而注射Wnt2b过表达质粒组小鼠肝组织Wnt2b蛋白水平升高,提示所用质粒有效性,可以用于干预TAA造模小鼠肝内Wnt2b水平,以评价Wnt2b对纤维化进程影响。结果显示,降低肝内Wnt2b水平将明显促进纤维化肝脏胶原沉积、HSCs活化及炎性细胞浸润,即加剧纤维化疾病进程;而升高肝内Wnt2b水平可抑制纤维化肝组织内胶原沉积、HSCs活化及炎性细胞浸润,说明Wnt2b具有抗纤维化发展的作用。4. Wnt2b抑制体外HSCs活化分离野生型C57BL/6小鼠原代HSCs,RT-PCR结果显示HSCs表达多种Wnt家族相关受体;比较静息期及活化期HSCs受体水平发现,活化型HSCs中Fzd4与Fzd7受体基因水平上调,提示Wnt2b对HSCs可能存在直接调控作用。进一步体外实验结果证实,Wnt2b条件培养基及瞬时转染Wnt2b过表达质粒均可显著抑制HSCs中α-SMA及Ⅰ型胶原基因与蛋白水平,提示旁分泌和/或自分泌来源的Wnt2b对HSCs活化存在负向调节作用。5. β-catenin在肝纤维化过程中上调与对照组相比,TAA造模组小鼠肝脏中β-Catenin基因及蛋白水平均呈现明显上调趋势。肝脏原位灌流法分离小鼠HSCs,结果显示,从纤维化肝脏分离的HSCs其β-Catenin表达水平高于对照组,且伴有入核增多现象;体外实验亦证明,在HSCs自活化过程中伴随着β-Catenin表达水平升高及核转位增多现象。6. Wnt2b可直接上调β-Catenin表达与对照组相比,尾静脉高压注射Wnt2b过表达质粒组小鼠肝脏中β-Catenin表达水平明显上调,提示Wnt2b可促进β-Catenin表达。体外实验中,Wnt2b条件培养基及瞬时转染Wnt2b过表达质粒均可显著上调HSCs中β-Catenin表达,提示旁分泌和/或自分泌来源的Wnt2b对HSCs中β-Catenin存在直接调控作用。7. Wnt2b抑制HSCs活化不依赖于β-Catenin经典通路应用β-catenin干扰质粒发现,沉默β-catenin并未削弱Wnt2b对LX2细胞α-SMA及Ⅰ型胶原的抑制作用,提示Wnt2b虽然可促进β-catenin表达及活化,但这并非是其发挥抗纤维化效应的关键机制,提示Wnt2b可能循其它通路调控HSCs活化及纤维化进程。8. TLR4在肝纤维化过程中上调与对照组相比,TAA造模组小鼠肝脏中TLR4基因及蛋白水平呈现明显上调趋势。肝脏原位灌流法分离小鼠HSCs,结果显示,从纤维化肝脏分离的HSCs其TLR4表达水平高于对照组。同时可观察到小肠细菌过度生长及菌群移位现象,提示TLR4通路与纤维化疾病进程的相关性。9. Wnt2b抑制TLR4介导的促纤维化及星状细胞活化效应与野生型小鼠相比,TLR4-/-小鼠纤维化进程减缓,肝内胶原沉积减少,佐证TLR4通路对于纤维化发展的重要作用。应用TLR4抑制剂可逆转沉默肝内Wnt2b而引起的HSCs活化、胶原沉积等效应,提示沉默肝内Wnt2b所引起的纤维化相关指标的上调是TLR4信号通路依赖的。进一步研究发现,Wnt2b不仅可抑制TLR4激动剂LPS对HSCs α-SMA及Ⅰ型胶原的上调效应,而且对TLR4通路增强TGF-β的促HSCs活化效应亦具有抑制作用,提示Wnt2b通过抑制TLR4信号通路,进而发挥限制HSCs活化及抗纤维化效应。10. Wnt2b负调HSCs胞内TLR4信号转导Real-time PCR及Western blotting结果显示,Wnt2b可显著抑制LX2细胞TLR4表达,降低NF-κB及MAPKs磷酸化。进一步体内研究证实,与对照组相比,高压注射Wnt2b过表达质粒组小鼠肝脏中TLR4通路相关分子受到明显抑制,而注射Wnt2b沉默质粒组小鼠肝脏中TLR4通路活化增高。肝脏原位灌流法分离小鼠HSCs,结果显示Wnt2b可显著抑制HSCs胞内NF-κB表达及核转位。以上结果提示,Wnt2b可抑制TLR4表达及相关信号分子活化。结论及意义1.本研究发现,Wnt2b在人及小鼠纤维化肝脏中表达升高,肝实质细胞是纤维化肝脏中表达Wnt2b的主要来源,活化后HSCs亦可一定程度上调Wnt2b表达;并且证实Wnt2b可以旁分泌和/或自分泌的形式抑制HSCs活化,发挥抗纤维化发展的作用;2.虽然β-Catenin在肝纤维化过程中表达和活化增加,且证实Wnt2b可直接促进β-catenin表达,但是沉默β-Catenin并不影响Wnt2b的抗纤维化效应,证明Wnt2b不是通过经典β-Catenin通路发挥抗HSCs活化及纤维化进程作用;3.本研究阐明,Wnt2b对于HSCs中TLR4通路存在负向调控作用,抑制TLR4通路信号转导及靶分子表达;Wnt2b可以抑制TLR4通路对HSCs的直接促活化效应,同时抑制TLR4通路增强HSCs对TGF-β敏感性的作用,从而抑制TLR4通路活化所介导的促纤维化效应。综上所述,本研究证实Wnt2b蛋白具有抗肝纤维化发展的效应。研究提示,Wnt2b可能作为一种新型内源性的TLR4抑制因子,通过负向调控纤维化进程中HSCs胞内TLR4信号通路以抑制HSCs活化,从而限制疾病进展,揭示了机体维持内环境稳态的一种新方式,为治疗纤维化相关肝脏疾病提供了新的思路与实验依据。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R575.2
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本文编号：2357574