乙醇对H4-ⅡE细胞脂质代谢及AMPK表达的影响

发布时间：2021-04-02 18:06

  目的：通过观察不同浓度乙醇作用于大鼠H4-ⅡE细胞,探讨乙醇对肝细胞脂质代谢及其相关蛋白表达的影响。方法:1.细胞培养将一定量大鼠H4-ⅡE细胞移至洁净培养瓶中,根据细胞密度加入适量DMEM培养液,于37℃,5% CO2培育箱中培养：2.MTT方法检测细胞活性将梯度浓度乙醇作用于细胞,作用时间分别设立为24 h、48 h、72 h,选择其中对细胞生长活性有一定影响的乙醇浓度作为实验浓度(0.2、0,4、0.6 mmol/l),实验时间设为24 h；3.细胞形态学观察HE染色、油红O染色、AnnexinV-FITC染色、免疫组化染色倒置显微镜下观察细胞形态学变化；4.免疫组化方法观察各实验组细胞腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein Kinase, AMPK)及过氧化物酶体增值物激活受体(Peroxisome Proliferator-activated Receptora, PPARa)的表达情况：5.Elisa方法检测梯度浓度乙醇作用细胞12 h、24 h、48 h、72 h后,各实验组细胞培养上清中AMPK,乙酰辅酶A羧化酶(Acectyl-CoA-Carboxylase ,ACC),游离脂肪酸(Free fatty acid, FFA)以及肉毒碱棕榈酰转移酶-1 (carnitine palmitoyl transferasel, CPT-1)的分泌量情况；6. Western blotting检测各实验组细胞内P-AMPK、PPAR-α、P-ACC、CPT-I的表达,7.流式细胞术检测各组细胞的凋亡情况。结果：1.MTT一定浓度的乙醇作用H4-ⅡE细胞后,对细胞的生长产生明显的抑制作用,且与作用时间以及乙醇的浓度密切相关(P0.05)；2.细胞形态学观察对照组细胞生长状态良好,各乙醇实验组细胞呈现出不同程度的凋亡形态学变化；3.免疫组化染色结果同对照组相比较,0.2,0.4、0.6 mol/1实验组细胞AMPK、 PPARa的阳性表达率明显下降；0.6 mol/1乙醇实验组AMPK、PPAR-a阳性表达率低于0.4 mol/1组,0.4 mol/1实验组AMPK、 PPAR-a阳性表达率低于0.2 mol/1组(P0.05)。4.Elisa结果在一定的乙醇浓度范围及作用时间内,乙醇可增加H4-ⅡE细胞培养上清中ACC,FFA、AMPK及CPT-Ⅰ的泄漏量(P0.05)；其中当乙醇浓度在0.1-1.4 mol/1范围内时,各乙醇实验组细胞AMPK及CPT-I的泄漏量随着乙醇的浓度增长作用时间的延长而逐渐增加；而1.6 mol/1组AMPK、CPT-I泄漏量(作用时间48 h、72 h)低于1.4 mol/1组,呈现下降趋势；5.Western blotting结果显示同对照组相比较,各乙醇实验组细胞P-AMPK、 P-ACC、PPARa及CPT-Ⅰ蛋白的表达量明显下降；随着乙醇浓度的增长,各组细胞P-AMPK、P-ACC. PPARa及CPT-Ⅰ蛋白的表达量逐渐下降(0.6 mol/1组0.4mol/1组0.2 mol/1组)(P0.05)。6.流式细胞术①同对照组相比较,各乙醇实验组细胞的凋亡率明显增加；且0.6mol/1组凋亡率0.4mol/1组0.2mol/1组(P0.05)；②同对照组相比较,各乙醇实验组正常活细胞数明显减少,且0.6mol/1组0.4 mol/1组0.2mol/1组(P0.05)；⑧同对照组相比较,各乙醇实验组凋亡细胞及死亡的细胞数显著增多,且0.6mol/1组0.4 mol/1组0.2 mol/1组(P0.05)。结论：1.乙醇对肝细胞的生长有抑制作用,并可诱导肝细胞的凋亡。2.乙醇可引起肝细胞脂质代谢紊乱,增加脂肪酸含量并抑制其氧化,其机制可能与AMPK等相关信号途径有关。
【学位授予单位】：延边大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R575

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本文编号：2387616