当前位置:主页 > 医学论文 > 消化疾病论文 >

NAFLD细胞模型构建、核酸适配体筛选及靶向药物运输

发布时间:2018-12-24 13:13
【摘要】:非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)是指除酒精以及其他明确损肝因素所致的肝细胞内甘油三酯过度沉积(5%的肝细胞组织)为主要特征的一种临床病理综合征。NAFLD不仅与2型糖尿病、肥胖有关,也是非酒精性脂肪肝炎(NASH)、肝硬化甚至肝癌发展的风险因素之一。近年来其发病率逐年增高,已经成为一个全球性的公共健康问题。目前治疗药物主要是针对改善胰岛素抵抗和抗氧化应激等,存在疗效不确切或药物副作用大等因素,尚无治疗NAFLD的特效药物问世。近年来,纳米和核酸适配体技术在载药及药物的靶向性研究中得到了越来越多的应用,是当前生物医学领域的研究热点。本文针对当前NAFLD治疗的一些难题以及治疗前景,通过多学科交叉,设计并构建了基于金纳米粒子和核酸适配体的载药载体,探索新型纳米载药载体在NAFLD治疗中的应用,为将来NAFLD进行靶向药物治疗提供新的思路。鉴于课题的设计,本论文共分为三个部分。 第一部分:NAFLD细胞模型的构建、核酸适配体筛选及其特性分析 目的:本部分拟建立NAFLD细胞模型,采用细胞指数级富集的配体系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands byExponential Enrichment,Cell-SELEX)针对NAFLD细胞进行筛选,获得能特异性识别NAFLD细胞表面膜蛋白结构的核酸适配体,分析筛选到的核酸适配体NFD-1的相关特征,包括不同温度下的特异性、亲和性以及膜蛋白结合性。 方法:使用100uM油酸和50uM棕榈酸诱导分化HepG2细胞1周构建NAFLD细胞模型;设计并合成随机DNA文库序列,中间25bp为随机序列,两端各有一段长16bp的引物序列,分别用异硫氰酸荧光素和生物素标记两端引物。将NAFLD细胞作为正细胞,HepG2细胞作为负细胞,将DNA文库与正负细胞反复孵育进行筛选,与正细胞结合而不与负细胞结合的文库序列采用聚合酶链法(PCR)扩增并用作下一轮筛选及鉴定。每3-4轮筛选就使用流式细胞技术对文库的富集程度进行监测、鉴定。最后采用454测序方法对富集到的文库进行测序,合成相关序列并通过流式细胞术进行鉴定;在4。C和37。C条件下将核酸适配体NFD-1与不同组织来源的细胞株孵育,流式细胞术测定其特异性,将NFD-1稀释成不同浓度后与NAFLD细胞孵育,计算其解离常数;使用Trypsin和Proteinase K两种蛋白酶检测NFD-1靶标为膜蛋白。 结果:本实验成功诱导分化建立了NAFLD细胞模型。应用Cell-SELEX技术对NAFLD细胞展开筛选,经过24轮正负筛选后成功富集到针对NAFLD细胞的ssDNA文库,经过测序分析找到了4条核酸适配体与NAFLD细胞有结合,而与HepG2细胞不结合,我们选用结合能力强的1条核酸适配体进行实验,并命名为NFD-1;在4。C和37。C条件下,核酸适配体NFD-1均能与NAFLD细胞特异性结合,而与其它组织来源的细胞株几乎没有结合。解离常数测定Kd值为21.5士5.6nM,提示NFD-1能与NAFLD细胞高亲和力结合。蛋白酶检测证实NFD-1的靶标为膜蛋白。 结论:通过Cell-SELEX技术针对NAFLD细胞进行筛选,获得了1条在4。C和37。C条件下能与靶细胞膜蛋白高亲和力、高特异性结合的核酸适配体NFD-1。 第二部分:金纳米粒子载药载体的构建 目的:合成并构建金纳米粒子载药载体,检测其特异性。 方法:化学合成直径为13nm的金纳米粒子,将NFD-1和载药GC序列修饰金纳米粒子构建载药载体,检测其与NAFLD细胞结合的特异性。 结果:我们合成了直径为13nm的金纳米粒子,并成功修饰了NFD-1和载药GC序列,检测结果表明修饰了NFD-1的金纳米粒子能特异性结合NAFLD细胞。 结论: NFD-1与载药GC序列修饰的金纳米粒子显示出良好的结合特异性。 第三部分:修饰阿霉素并检测修饰了NFD-1和Dox的金纳米载药载体的靶向载药运输 目的:将阿霉素(Doxycycline,Dox)修饰到金纳米载药载体并检测Dox的效率;检测修饰了核酸适配体NFD-1和Dox的的金纳米载药载体能否特异性进入NAFLD细胞。 方法:共聚焦显微镜检测修饰了核酸适配体NFD-1和Dox的金纳米载药载体特异性进入NAFLD细胞。 结果:修饰了载药GC序列的金纳米载药载体能结合300倍Dox的剂量,共聚焦显微镜显示修饰了NFD-1和Dox的的金纳米载药载体能特异性地进入NAFLD细胞。 结论:修饰了核酸适配体NFD-1和Dox的金纳米载药载体能特异性地进入NAFLD细胞。
[Abstract]:......
【学位授予单位】:中南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:R575.5

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 崔承;蒋宇扬;;核酸适配体及其相关药物研究进展[J];中国新药杂志;2011年05期

2 梁红茹;杨松涛;张涛;胡桂秋;夏咸柱;;核酸适配体及其在病原微生物学中的应用[J];生物工程学报;2011年05期

3 姚远;张波;;核酸适配体及其应用研究进展[J];国际检验医学杂志;2014年08期

4 甘龙杰;兰小鹏;;适配体芯片技术及其应用[J];临床检验杂志;2009年06期

5 兰小鹏;;适配体技术及其在医学检验研究中的作用[J];临床检验杂志;2012年10期

6 李晓佩;杨良嵘;黄昆;李文松;孙西同;刘会洲;;核酸适配体在生化分离及检测领域中的研究进展[J];化工学报;2013年01期

7 刘婷先;张娜;;适配体在肿瘤治疗方面的应用[J];生命的化学;2013年05期

8 唐德平;张宇洁;毛爱红;;适配体在体外细胞检测中的应用[J];重庆医学;2014年13期

9 李红玉;阎辉;;适配体与病毒性感染诊断及治疗[J];中国生物化学与分子生物学报;2013年05期

10 满燕;吕雪飞;彭广;宋达;庆宏;;双适配体夹心微阵列芯片在凝血酶检测中的应用[J];生命科学仪器;2014年Z1期

相关会议论文 前10条

1 蔡圣;刘彩云;卢建忠;;基于核酸适配体和酶循环放大的腺苷化学发光检测[A];中国化学会第十届全国发光分析学术研讨会论文集[C];2011年

2 陈巍;赵新颖;屈锋;;毛细管电泳法筛选蛋白质的核酸适配体的初步研究[A];全国生物医药色谱学术交流会(2010景德镇)论文集[C];2010年

3 杨晓娟;邴涛;梅宏成;上官棣华;;核酸适配体用于手性拆分L型和D型色氨酸[A];全国生物医药色谱学术交流会(2010景德镇)论文集[C];2010年

4 郑冬梅;娄新徽;;一种基于结构开关型适配体的无标记荧光传感法[A];中国化学会第28届学术年会第9分会场摘要集[C];2012年

5 薛利云;周小明;邢达;;基于核酸适配体探针和酶辅助荧光信号扩增的等温高灵敏度蛋白检测方法[A];中国光学学会2011年学术大会摘要集[C];2011年

6 马文韬;古力;屈锋;;毛细管电泳筛选大肠杆菌适配体的初步研究[A];全国生物医药色谱学术交流会(2010景德镇)论文集[C];2010年

7 梁好均;徐华国;邓伟;;核酸适配体链构象转变的研究[A];2014年两岸三地高分子液晶态与超分子有序结构学术研讨会摘要集[C];2014年

8 王晓芳;程琳;耿霞;赵强;;基于适配体修饰的磁珠和量子点荧光法检测凝血酶[A];中国化学会第28届学术年会第9分会场摘要集[C];2012年

9 汪海林;章大鹏;;单核苷水平核酸适配体与蛋白质相互作用分析[A];中国化学会第28届学术年会第9分会场摘要集[C];2012年

10 温桂清;范燕燕;梁爱惠;蒋治良;;核酸适配体纳米金共振散射光谱检测血清中钾离子[A];中国化学会第十五届全国有机分析及生物分析学术研讨会论文集[C];2009年

相关重要报纸文章 前3条

1 潘文;核酸适配体在医药领域应用前景广阔[N];中国医药报;2010年

2 于洋 田野;蛋白质检测有了新方法[N];吉林日报;2011年

3 记者 耿挺;人工核酸将用于食品新鲜度检测[N];上海科技报;2007年

相关博士学位论文 前10条

1 严喜鸾;基于核酸适配体化学发光检测新技术的研究[D];复旦大学;2009年

2 胡献刚;新兴适配体在高效净化/诊断环境与生物体内污染物的特点及其机理[D];南开大学;2012年

3 何婧琳;基于构象转换和聚合酶反应的核酸适配体传感分析方法及应用研究[D];湖南大学;2010年

4 邓昆;非标记型电化学适配体传感器的构建及其在蛋白质检测中的应用[D];第三军医大学;2013年

5 段诺;食源性致病菌适配体的筛选及分析应用研究[D];江南大学;2013年

6 黎泓波;基于信号放大核酸适配体和G-四链体探针的生化分析新方法[D];湖南大学;2013年

7 王红旗;DNA和蛋白质生物标志物光学分析新方法[D];湖南大学;2011年

8 申睿;基于功能寡核苷酸分子的蛋白质检测新方法研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2010年

9 倪Y罴,

本文编号:2390668


资料下载
论文发表

本文链接:https://www.wllwen.com/yixuelunwen/xiaohjib/2390668.html


Copyright(c)文论论文网All Rights Reserved | 网站地图 |

版权申明:资料由用户c3dd0***提供,本站仅收录摘要或目录,作者需要删除请E-mail邮箱bigeng88@qq.com