过氧化物酶体增殖物激活受体α对急性肝衰竭的保护作用与机制

发布时间：2017-02-13 17:11

  本文关键词：过氧化物酶体增殖物激活受体α对急性肝衰竭的保护作用与机制，由笔耕文化传播整理发布。

《河北医科大学》 2014年

过氧化物酶体增殖物激活受体α对急性肝衰竭的保护作用与机制

焦明静  

【摘要】：目的：急性肝衰竭是一种由炎症介导的肝细胞损伤过程，预后极差，其器官损伤的免疫学机制尚未完全阐明，寻求新的治疗方法一直是该病研究的热点和难点。过氧化物酶体增殖物激活受体α（peroxisomeproliferator-activated receptor α， PPAR α）是由配体激活的核转录因子，已被证实参与了细胞脂质代谢、凋亡及炎症反应等。尽管多项研究表明PPAR α具有明确的抗炎作用，但在炎症作为其主要病生理机制的急性肝衰竭的发生发展过程中，PPAR α的作用及机制如何目前国内外尚无研究报道。本研究的目的在于探讨PPAR α对急性肝衰竭的保护作用与机制。 方法：本实验共分如下两部分。 1动物实验 通过D-氨基半乳糖（D-Galactosamine， D-GalN）联合脂多糖（Lipopolysaccharide， LPS）腹腔注射构建小鼠急性肝衰竭模型，检测PPAR α在疾病进展过程中的动态表达变化及组织分布情况；给予PPAR α的选择性激动剂Wy-14,643干预，观察PPAR α对小鼠急性肝衰竭是否具有保护作用；分别用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine，3-MA）及自噬相关基因7的小干扰RNA(small interfering RNA against autophagyrelated gene7， siAtg7）抑制细胞自噬，观察自噬受抑后能否逆转PPAR α对小鼠急性肝衰竭的原有保护作用,以深入探讨PPAR α对D-GalN/LPS诱导的小鼠急性肝衰竭的作用机制。组织病理学分析及血清丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）活性测定观察肝组织损伤的严重程度；实时定量PCR（Real Time-PCR)检测PPAR α、促炎性细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）、趋化因子（CXCL-1、CXCL-10）、自噬相关基因（ATG-5、ATG-7、LAMP-1）的mRNA表达；蛋白印迹法（Western Blot）检测PPARα、炎症信号通路相关蛋白（p-NF-κBp65、p-JNK、p-ERK、p-P38）、自噬相关蛋白（LC3、ATG-5、ATG-7、LAMP-1）的蛋白表达。 2原代细胞实验 通过LPS刺激小鼠骨髓来源的原代巨噬细胞(Bone marrow derivedmacrophage, BMM)制作原代细胞炎症模型，给予Wy-14,643干预，从细胞学水平观察PPAR α活化能否诱导细胞自噬，抑制炎症反应；分别用3-MA、siAtg7抑制细胞自噬，观察自噬受抑后能否逆转PPAR α的原有抗炎作用，以进一步探讨PPAR α对急性肝衰竭发挥保护作用的细胞学机制。向原代巨噬细胞中转染GFP-LC3质粒并于荧光显微镜下观察以检测自噬小体的形成情况；Real Time-PCR检测促炎性细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）、趋化因子（CXCL-1、CXCL-10）的mRNA表达；Western Blot检测自噬相关蛋白（LC3、ATG-5、ATG-7、LAMP-1）的表达。 结果： 1PPAR α在急性肝衰竭时表达受抑，肝组织PPAR α的mRNA和蛋白表达水平在急性肝衰竭疾病进展过程中逐渐降低。 2PPAR α活化促进了细胞自噬，抑制了急性肝衰竭时的炎症反应，对急性肝衰竭产生保护作用。与急性肝衰竭模型组相比，PPAR α的选择性激动剂Wy-14,643干预组小鼠肝大体形态接近于正常的肝脏，肝小叶结构完整，部分肝细胞呈气球样变，小叶内及汇管区炎细胞浸润不明显，血清ALT、AST水平降低，促炎性细胞因子、趋化因子的mRNA及磷酸化的NF-κBp65、ERK、JNK蛋白表达减少；自噬相关基因ATG-5、ATG-7、LAMP-1和蛋白LC3、ATG-5、ATG-7、LAMP-1表达增加，且差异具有统计学意义。 3抑制自噬后加重了急性肝衰竭时的肝脏损伤和炎症反应，逆转了PPAR α对急性肝衰竭的原有保护作用。分别用3-MA、siAtg7抑制自噬后，小鼠肝呈黝黑色，肝细胞大片状坏死，肝索解离，肝小叶结构无法辨认，汇管区及坏死区可见大量中性粒细胞和淋巴细胞等炎症细胞浸润，血清ALT、AST水平升高，促炎性细胞因子及趋化因子的表达增加，且差异具有统计学意义。 4在原代巨噬细胞炎症模型中，PPAR α活化抑制了LPS诱导的炎症反应，而且PPAR α的抗炎作用具有剂量依赖性。Real Time-PCR结果显示分别用10μM、25μM、50μM的Wy-14,643干预LPS诱导的原代巨噬细胞炎症模型，观察到促炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6及趋化因子CXCL-1、CXCL-10的mRNA表达逐渐减少，表明PPAR α活化可抑制细胞炎症反应，且PPAR α的抗炎作用具有剂量依赖性。 5在原代巨噬细胞炎症模型中，PPAR α活化促进了细胞自噬，而且PPAR α对自噬的诱导作用具有剂量依赖性。我们分别用10μM、25μM、50μM的Wy-14,643干预已转染入GFP-LC3质粒的原代巨噬细胞并于荧光显微镜下观察，发现随着Wy-14,643干预浓度的增加，原代巨噬细胞内自噬小体的形成逐渐增多；Western Blot结果显示随着Wy-14,643干预浓度的增加自噬相关蛋白LC3、ATG-5、ATG-7、LAMP-1的表达逐渐增多，说明PPAR α活化可以诱导细胞自噬，且PPAR α对自噬的诱导作用具有剂量依赖性。 6细胞自噬受抑后，逆转了PPAR α的原有抗炎作用，，加剧了LPS诱导的原代巨噬细胞炎症反应。Real Time-PCR结果显示与单用Wy-14,643激活PPAR α相比，在加用3-MA、siAtg7抑制细胞自噬后，原代巨噬细胞中促炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6及趋化因子CXCL-1、CXCL-10的mRNA表达增加，说明细胞自噬受抑可使PPAR α的原有抗炎作用不复存在。 结论： 1PPAR α在急性肝衰竭的疾病进展过程中表达受抑。 2PPAR α活化通过促进细胞自噬减轻肝组织的炎症反应，对急性肝衰竭产生保护作用。 3抑制自噬可加重急性肝衰竭时的肝脏损伤及肝组织的炎症反应，逆转PPAR α对急性肝衰竭的原有保护作用。 4PPAR α可能成为临床上防治急性肝衰竭的一个新的、重要的靶点。

【关键词】：
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R575.3
【目录】：

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