熊果酸对PDGF诱导的活化型肝星状细胞内NOX信号通路的影响

发布时间：2019-09-06 13:17

【摘要】：背景：肝纤维化是由多种病因所致的一种慢性肝损伤，在其发展过程中持续存在创伤愈合反应。肝星状细胞（hepatic stellate cells, HSCs）作为细胞外基质（extracellular matrix, ECM）的主要来源，它的激活、增殖和转化是肝纤维化发病的关键。近年研究表明，HSCs内的信号转导主要由NADPH氧化酶（NADPHoxidase, NOX）产生的活性氧簇（reactive oxygen species, ROS）所调控，因此通过抑制HSCs内NOX的活性，阻断促纤维化因子在HSCs内信号通路的传递，有望成为抑制肝纤维化的新方法。本课题组前期研究发现熊果酸（ursolic acid，UA）可抑制瘦素诱导活化型HSCs的NOX的表达及其调控的信号通路活化。血小板衍生生长因子（Platelet-derived growth factors，PDGFs）、转化生长因子-β（TGF-β）等多种促纤维化因子均参与HSCs的激活与增殖，熊果酸是否能阻断瘦素以外的促纤维化因子引起的HSC内信号通路激活，尚待进一步研究。因此，本课题在前期研究基础上，继续探讨熊果酸对PDGF诱导的HSCs内NOX激活及纤维化信号通路的影响，力求阐明熊果酸抗纤维化的作用靶点和机制。目的：观察熊果酸对PDGF诱导的大鼠活化型肝星状细胞（HSC-T6）NOX激活及下游信号通路活化的影响。方法：取对数生长期HSC-T6细胞，随机分成以下各组：空白对照组、Rosup阳性对照组（5μg/ml）、熊果酸组（50μM）、PDGF-BB组（10ng/ml）、熊果酸干预组(熊果酸50μM+PDGF-BB10ng/ml)、DPI干预组（DPI20μM+PDGF-BB10ng/ml）、SB203580干预组（SB20358010μM+PDGF-BB10ng/ml）、LY294002干预组（LY29400210μM+PDGF-BB10ng/ml）。为观察熊果酸对I型胶原表达的影响，药物分别处理HSC-T612h、24h后，采用荧光定量PCR检测I型胶原mRNA的表达；为观察熊果酸对NOX亚基p47phox蛋白膜移位的影响，药物分别处理15min、30min、60min后，采用Western-blotting检测膜蛋白p47phox的表达；为观察熊果酸对HSCs内ROS水平的影响，药物分别处理10min、30min、1h、2h后，采用活性氧检测试剂盒，利用活细胞工作站及荧光酶标仪检测DCF荧光强度，观察ROS水平；为观察熊果酸对NOX调控的信号通路PI3K-Akt、P38MAPK的影响，药物分别处理15min、30min、60min后，采用Western-blotting检测PI3K、P-AKT、P-P38MAPK蛋白的表达。结果： 1．熊果酸对PDGF诱导HSC-T6内I型胶原mRNA表达的影响 HSC-T6经药物刺激12h后，PDGF组I型胶原mRNA的表达比空白对照组明显增加（P0.01）；熊果酸干预组I型胶原表达较PDGF组明显下降（P0.01），较空白对照组无显著统计学差异（P0.05）；熊果酸组I型胶原的表达低于空白对照组（P0.05）；DPI干预组、SB203580干预组及LY294002干预组I型胶原的表达都明显低于PDGF组（P0.01）；熊果酸干预组、DPI干预组、SB203580干预组和LY294002干预组之间I型胶原表达的差异无统计学意义（P0.05）。以上结果说明熊果酸可抑制PDGF-BB诱导的I型胶原mRNA的表达。 2．熊果酸对PDGF诱导的HSC-T6细胞p47phox亚基向膜移位的影响 HSC-T6经药物作用15min后，PDGF组膜蛋白p47phox表达比空白对照组显著增加（P0.05）；熊果酸干预组p47phox的表达较PDGF组明显降低（P0.05），，而与空白对照组无显著统计学差异（P0.05）；熊果酸组p47phox的表达明显低于空白对照组（P0.01）；DPI、SB203580及LY294002干预组p47phox的表达均低于PDGF组（P0.05）。熊果酸干预组、DPI干预组、SB203580干预组和LY294002干预组之间膜蛋白p47phox的表达在统计学上无显著差异（P0.05）。以上结果说明熊果酸可下调PDGF介导的NOX亚基p47phox蛋白的向膜移位。 3.熊果酸对PDGF介导的HSC-T6内ROS生成的影响 HSC-T6经药物作用1h后，PDGF组DCF荧光强度比空白对照组明显升高（P0.01），与Rorup阳性对照组无显著差异（P0.05）；熊果酸干预组和DPI干预组的DCF荧光强度均显著低于PDGF组和Rosup阳性对照组（P0.01），与空白对照组无显著差异（P0.05）；熊果酸组的DCF荧光强度显著低于空白对照组（P0.01）；熊果酸干预组、DPI干预组之间DCF荧光强度的差异无统计学意义（P0.05）。以上结果说明熊果酸可下调PDGF介导的HSC-T6内ROS的产生。 4．熊果酸对PDGF诱导的HSC-T6内PI3K-Akt、P38MAPK信号通路的影响 4.1.熊果酸对PDGF介导的HSC-T6内PI3K表达的影响 HSC-T6经药物作用30min后，PDGF组PI3K蛋白表达显著高于空白对照组（P0.01）；熊果酸干预后PI3K蛋白的表达低于PDGF组和空白对照组（P0.01，P0.05）；熊果酸组PI3K的表达低于空白对照组（P0.01）；DPI及LY294002干预后PI3K的表达均低于PDGF组（P0.01）；熊果酸干预组、DPI干预组、LY294002干预组之间PI3K表达的差异无统计学意义（P0.05）。以上结果说明熊果酸可下调PDGF介导的PI3K蛋白的表达。 4.2.熊果酸对PDGF介导的HSC-T6内p-Akt表达的影响 HSC-T6经药物作用30min后，PDGF组p-Akt蛋白表达显著高于空白对照组（P0.01）；熊果酸干预组p-Akt蛋白的表达较PDGF组显著下降（P0.01），较空白对照组差异无统计学意义（P0.05）。熊果酸组P-Akt的表达明显低于空白对照组（P0.01）；DPI干预组及LY294002干预组P-Akt表达均低于PDGF组（P0.05）；熊果酸干预组、DPI干预组、LY294002干预组之间p-Akt表达的差异无统计学意义（P0.05）。以上结果说明熊果酸可下调PDGF介导的p-Akt蛋白的表达。 4.3.熊果酸对PDGF介导的HSC-T6内P-P38MAPK表达的影响 HSC-T6经药物作用30min后，PDGF组P-P38MAPK蛋白表达显著高于空白对照组（P0.01）；熊果酸干预后P-P38MAPK蛋白的表达较PDGF组显著下降（P0.01），较空白对照组差异无统计学意义（P0.05）。熊果酸组P-P38MAPK的表达明显低于空白对照组（P0.01）；SB203580及DPI干预组P-P38MAPK表达均低于PDGF组（P0.01）；熊果酸干预组、DPI干预组、SB203580干预组之间P-P38MAPK表达的差异无统计学意义（P0.05）。以上结果说明熊果酸可下调PDGF介导的P-P38MAPK蛋白的表达。结论： 1、PDGF能诱导HSC-T6细胞的NOX亚基p47phox蛋白膜移位使NOX活化，并引起P38MAPK、PI3K-Akt信号通路的激活及I型胶原mRNA的表达增加。 2、熊果酸可抑制PDGF诱导HSC-T6细胞I型胶原mRNA的表达，其机制可能与通过抑制NOX亚基p47phox蛋白膜移位，阻止NOX活化产生ROS，从而阻断P38MAPK、PI3K-Akt信号通路的激活有关。
【图文】：

I型胶原,熊果酸,药物作用,附图

图 3.1 HSC-T6 的 I 型胶原 mRNA 的表达情况PDGF诱导HSC-T6 细胞p47phox图3.2、附图2所示：HSC-T6经药物作用15min后，蛋白向膜上白对照组显著增加（P<0.05）；熊果酸干预组

膜蛋白,药物作用,阳性对照,附图

图 3.2 HSC-T6 膜蛋白p47phox PDGF 诱导的 HSC-T6 内 ROS 生成的影的表达情况图3.3、附图3所示：HSC-T6经药物作用1h后，PDG组明显升高（P<0.01），与Rorup阳性对照组无显著
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R575.2

【参考文献】