HNF4α调控Pellino1在非酒精性脂肪性肝炎中的作用机制研究

发布时间：2019-11-09 00:52

【摘要】：背景非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)是非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)疾病进展中的重要阶段,随着疾病的发展可以进展为肝硬化和肝癌。流行病学调查显示,在肥胖人群中NAFLD的患病率显著提高,肥胖状态可导致糖类和脂肪代谢失衡,造成胰岛素抵抗,从而产生脂肪肝。因此,肥胖病和NAFLD的关系越来越受到关注,对于NAFLD的预防和治疗已成为世界性的问题。在NASH的疾病进展过程中,TLRs/IL-1R样信号通路发挥了重要作用,Pellino1是一种新发现的具有E3泛素连接酶活性的蛋白,在TLRs/IL-1R介导的炎症信号通路中起着关键调控作用,这与Pellino1通过使TLRs/IL-1R信号通路中关键蛋白(如TRAF6、RIP1)泛素化,调节NK-κB的核转位有关。Pellino1在NASH的发展进程中是否发挥调控作用?其发挥作用的机制是否与其对炎症的调控作用相关,尚不清楚。肝细胞核因子4(Hepatocyte nuclear factor 4α,HNF4α)是核蛋白受体超家族中的一员,在基因的转录调控中发挥着重要作用。HNF4α在肝脏中高表达,并在肝脏糖脂代谢中发挥重要作用。经研究发现,长链脂肪酸和乙酰辅酶A可以作为其配体激活其与DNA启动子的结合活性。而在NASH发展进程中,机体内FFA水平上升,可能作为转录因子和信号通路的配体激活其活性。我们通过对Pellino1启动子生物信息学分析发现,在Pellino1的启动子上存在着HNF4α的潜在结合位点。据此我们提出假说:在NASH发展进程中,FFA可以通过激活HNF4α进而调控Pellino1的基因表达,从而调控NASH的炎症反应过程。目的1.探讨Pellino1在MCD饮食诱导的NASH发生发展中的的作用及其机制2.阐明在FFA诱导的肝细胞中,HNF4α在转录水平对Pellino1的调控作用方法1.动物模型为了阐明Pellino1在NASH中的作用以及其可能的机制,动物实验采用蛋氨酸-胆碱缺乏(methionine-choline-deficient,MCD)饮食喂养8周构建NASH小鼠模型。采用Adv-cre 4x109经尾静脉注射Pellino1 Fln/Fln小鼠,敲除肝脏组织Pellino1表达。C57/BL6小鼠给予MCD饮食和对照Control饮食8周;Fln/Fln小鼠尾静脉注射Cre腺病毒和等剂量GFP病毒后1周后开始MCD 8周,观察小鼠肝脏大体形态变化;检测小鼠体重、肝脏体重、肝脏体重比;HE染色观察肝脏炎性细胞、脂肪浸润;甘油三酯酶法检测血液及组织中甘油三酯(Triglyceride,TG)含量;检测谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)和谷草转氨酶(Aspartate transaminase AST)水平;F4/80和CD45免疫组化方法检测巨噬细胞和淋巴细胞浸润水平。Western blot方法检测Pellino1、HNF4α蛋白水平,RT-PCR方法检测炎症因子水平。2.细胞模型体外细胞实验采用游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)刺激肝原代细胞,通过Western blot方法检测Pellino1、HNF4α蛋白水平,通过RT-PCR方法检测炎症因子IL-1β、TNFα、MCP-1的m RNA水平,通过报告基因实验和CHIP实验检测转录因子HNF4α与Pellino1启动子结合水平。结果一、Pellino1敲除改善MCD饮食诱导的NASH肝组织中的炎症反应1.与对照饮食组小鼠相比,MCD组小鼠肝脏脂肪沉积明显增加,肝小叶结构破坏,炎症细胞浸润明显,血浆ALT水平上升,Pellino1蛋白、m RNA水平上升。2.Cre病毒Pellino1敲除组小鼠与空载病毒转染组相比脂肪积聚、炎症细胞浸润减少,炎症因子IL-1β、TNFαm RNA水平下降,p-IκBα表达减少。3.FFA处理组肝细胞与BSA对照组相比,炎症因子水平上升;Peli1敲除组与空载病毒组相比,炎症因子水平有一定程度下降。二、在NASH模型中,HNF4α在转录水平调控Pellino11.在报告基因实验中,HNF4α转录组与对照质粒组相比,Pellino1启动子活性明显上升。突变Pellino1启动子组与完整启动子组相比,启动子活性明显下降。2.在CHIP实验中,HNF4α组与对照Ig G组相比,Peli1结合活性明显上升,FFA刺激后,结合活性上升。结论实验结果显示Pellino1在MCD饮食诱导的NASH发展进程中发挥了重要的作用,而脂肪代谢相关转录因子HNF4α可以增强Pellino1启动子活性从而促进Pellino1蛋白表达,并促进FFA诱导的体外培养肝细胞炎症因子的分泌。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R575.1

【相似文献】