腹泻标本中病原体快速检测流程的建立与评价

发布时间：2019-11-30 21:07

【摘要】：目的：针对重要的常见致腹泻病原,包括沙门菌、志贺菌、致病性弧菌(主要包括霍乱弧菌和副溶血性弧菌)、致泻性大肠杆菌(EPEC、ETEC、EIEC、EHEC、EAEC),诺如病毒、札如病毒、轮状病毒、肠道腺病毒和人星状病毒,建立整合PCR作为初筛技术的腹泻病原体快速检测流程,评估该流程的实际应用价值。初步掌握监测点腹泻症候群病原谱特征,了解所分离病原体的血清分型、毒力基因特征和耐药情况。方法： 1、选择无锡市7家哨点医院作为监测点,收集腹泻病例基本信息,采集病例粪便标本,用传统方法对致泻性大肠杆菌、志贺菌、沙门菌和致病性弧菌(主要包括霍乱弧菌和副溶血性弧菌)进行分离培养和鉴定,对分离到的菌株进行血清分型、毒力基因鉴定和药敏实验。 2、对粪便标本提取总核酸(包括DNA和RNA),对细菌分离培养不同环节提取核酸,包括增菌液核酸和EMB平板的菌苔核酸,对粪便核酸和中间核酸进行不同目标病原检测。多重常规PCR检测致泻大肠杆菌的靶基因,多重荧光PCR检测沙门菌、志贺菌、副溶血性弧菌和霍乱弧菌的靶基因,单重荧光PCR技术检测标本中的目标病毒。结果： 1、2013年4月至12月共采集334例腹泻病例粪便标本,常规培养法分离到目标菌30株,总阳性率为9.0%。其中沙门菌18株,致泻性大肠杆菌6株,志贺菌、霍乱弧菌和副溶血性弧菌各2株。 2、PCR检测结果：①致泻性大肠杆菌：粪便标本中检测到18份阳性,经测序证实13份含相应的靶序列,5份为非特异性扩增,其中2份与常规培养结果一致；平板菌苔中21份阳性,经测序证实均含靶序列,5份与常规培养结果一致。②志贺菌：粪便标本中检出8份阳性,经测序证实均含志贺菌靶序列,其中2份与常规培养结果一致。③沙门菌：粪便中检出1份阳性；增菌液中22份阳性,经测序证实均含靶序列,22份阳性中与常规培养结果一致的为18份。④副溶血性弧菌：粪便和增菌液中均检出2份阳性,且与分离培养结果一致。⑤霍乱弧菌：粪便中检出1份阳性；增菌液中2份阳性,与分离培养结果一致。 3、目标病毒核酸阳性83份,总检测阳性率24.9%。阳性率由高到低依次为NV11.7%、 RV8.4%、EADV2.1%、ASTV1.5%、SPAV1.2%.这些病毒感染有明显的季节特征,冬春季为发病高峰。 4、沙门菌血清型呈现多样性,以E群为主,对多种抗生素显示出不同程度的耐药。致泻性大肠杆菌对萘啶酸和甲氧苄啶/磺胺甲VA唑的耐药程度较高。结论： 1、基于PCR作为初筛技术的腹泻病原体检测流程用于腹泻症候群病原体监测快速、准确、高效。新的筛查技术方案为：①致泻性大肠杆菌：粪便标本接种肠道菌分离平板,用多重PCR检测第一区菌苔,阳性标本则从平板上挑取单菌落进行相应毒力基因鉴定。②志贺菌：直接对标本进行荧光PCR检测,阳性标本进行进一步分离培养。③沙门菌、霍乱弧菌和副溶血性弧菌：选择性增菌,对增菌液采用荧光PCR检测,阳性标本接种相应选择性平板进行进一步分离培养。 2、沙门菌、致泻性大肠杆菌、诺如病毒和轮状病毒是当年主要的致腹泻病原。夏季以细菌性腹泻为主,冬春季以病毒性腹泻为主。
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R440;R574.62

【参考文献】