缩宫素通过诱导自噬延缓肝细胞衰老的机制研究

发布时间：2020-03-20 17:32

【摘要】：研究背景及意义临床研究中发现,老年供肝受体移植术后的预后不佳与供肝的质量不理想密切相关,而肝细胞衰老是导致老年供肝质量不理想的主要原因之一。衰老可以使哺乳动物组织稳态失调和器官再生能力下降,主要是小幅度慢性应激促进细胞损伤积累的结果。自噬在细胞衰老的过程中发挥了重要作用,自噬水平的降低是衰老的标志之一。探究肝脏衰老的机制并延缓肝细胞衰老,促进肝细胞再生对改善老年肝脏质量,延缓肝脏相关的诸多疾病的进展具有十分重要的意义。缩宫素(Oxytocin,OT)是由下丘脑的视上核与室旁核合成,并且存储于神经垂体的一种激素。然而,近些年的研究发现,除中枢神经系统外,机体很多外周器官,如心脏、子宫、胸腺和消化道等都能够合成和释放OT,部分细胞表面表达缩宫素受体(Oxytocin Receptor,OTR)。最新研究发现,OT可促进缺血后的心肌的修复、成纤维干细胞及骨骼肌干细胞的分化和再生以及成年海马神经的再生。OT还可以通过改善其肌肉干细胞功能来恢复老龄小鼠的肌肉再生[1]。肝脏中是否也存在OTR,其激活是否可以延缓肝细胞衰老,仍未可知。本课题中我们主要研究肝脏中OTR的表达、分布特点及在肝细胞再生和延缓肝细胞衰老中的作用及机制。我们发现肝细胞表达OTR,在人的肝组织中其表达水平随年龄增长而逐渐降低,在老龄鼠的肝组织中其表达水平较青年鼠也明显降低。如此一致的是,人和小鼠血清中OT水平也随年龄增加而明显降低。利用肝细胞培养及小鼠肝类器官实验等体外实验发现OT可以促进肝细胞再生。进一步通过在体肝大部切除-肝再生模型及CC14引起的急性肝损伤病理模型研究发现OT促进老龄小鼠的肝再生,缓解CC14引起的急性肝损伤,促进修复。值得注意的是我们发现OT促进肝细胞自噬,不管是来自体外还是体内研究。老龄小鼠肝组织自噬水平明显低于青年小鼠,OT明显提高老龄小鼠肝自噬水平而对青年小鼠没有明显作用,这与OT改善老年肝再生的结果一致。该结果提示OT可能通过诱导自噬来延缓肝细胞衰老,从而实现对老年供肝的肝移植后功能改善,为提高老年供肝质量提供理论和实践基础。研究方法1.小鼠肝细胞株:实验采用的细胞是AML12细胞(即小鼠肝实质细胞),买自中国科学院的干细胞库。AML12细胞培养的条件是在含有10%的FBS、1%的ITS Liquid Media Supplement(100x)、1%的双抗(青霉素/链霉素)以及40ng/ml的Dexamethasone相混合的DMEM/F-12培养基中。需要37℃,5%C02的条件下,静置培养于C02培养箱中。细胞在瓶中生长70%-80%密度后,进行下一步的细胞实验。2.小鼠肝脏类器官模型:采用C57BL/6种类雄性小鼠,安乐处理后,取出并剪碎肝脏组织。用配制的含有0.3mg/ml Colllganase Ⅱ(胶原酶Ⅱ型)、0.3mg/ml Dispase Ⅱ的DMEM/F-12with15mMHEPSS消化液消化,此过程在37℃的恒温摇床上进行,大约2h,共6次。经70μm cell strainer过滤后,滤液再经37μm Reversible Strainer过滤以及Advanced DMEM/F-12反向冲洗。290g,8℃低速水平冷冻离心机离心,将含有胆管片段的滤液富集。最后用Corning(?)Matrigel(?)Basement Membrane Matrix与收集的胆管片段均匀混合,50μl/孔,接种于24孔板内;约15min,基质胶凝固,再加入HepatiCultTM Organoid Growth Medium(Mouse),500μl/孔。于温度37℃和5%的二氧化碳的原代培养箱里培养。3.动物建模:第一,采用2-3months和12months的C57BL/6雄性小鼠,建造肝脏大部切除-肝再生模型,随机的分为了两个组,分别为Control组和OT组,每组6只,OT处理采用皮下注射。第二,用12months的C57BL/6雄性小鼠,建造了 CC14急性肝损伤的模型,随机分为四个组,分别是Oil(玉米油)、CC14(玉米油作为溶剂)、CCl4+OT(0.1mg/kg)、CCl4+OT(1mg/kg),实验周期为2周。CCl4采用腹膜腔注射;OT采用皮下注射的方法进行。4.细胞模型检测相关指标:对细胞所做的处理分为三部分,第一部分是用CCK-8试剂盒检测不同浓度的OT对AML12细胞增殖的影响;第二部分是运用Western Blot检测了 AML12细胞中OTR的表达,检测不同浓度OT直接作用或先用雷帕霉素(rapamycin)预处理后对AML12细胞中LC3Ⅱ、LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白的影响;第三部分是对AML12细胞转染LC3 Lentivirus,利用免疫荧光检测rapamycin预处理后不同浓度OT对自噬流的影响。5.小鼠肝脏类器官模型检测指标:不同浓度OT处理,检测在Oh、12h、36h、72h时间段内与对照相比的类器官的数量和大小差异,以及对4个时间段进行拍照记录;使用Western Blot检测类器官中OTR的表达。6.动物模型检测相关指标:在肝脏大部切除手术-肝再生模型中,肝脏切除3天后,小鼠取材,称取剩余肝脏的重量,数据统计,计算与对照组相比OT处理组肝脏再生情况的这种差异。在CCl4-急性肝损伤模型中,利用了 HE染色,检测不同处理组小鼠肝内部形态的变化;用肝功专用检测试剂盒,测定小鼠血清中AST及ALT的含量;利用免疫荧光对小鼠肝脏中的OTR的分布进行定位;利用Westem Blot检测肝脏组织中OTR的表达,检测不同处理组小鼠肝脏组织LC3Ⅱ/Ⅰ Beclin-1蛋白的变化。研究结果1.Western Blot检测发现OTR在小鼠肝脏组织、AML12细胞以及小鼠肝脏类器官中均有表达。免疫荧光结果显示OTR在肝组织的分布比较广泛,主要存在于细胞膜上。2.不同月龄小鼠的OTR的表达不同,出现随着年龄的增加,OTR的表达呈下降的趋势。不同年龄的人的肝脏组织OTR的表达也随着年龄的增加而下降。与此一致的是,人和小鼠血清样本中OT水平也随年龄增长显著下降。3.OT促进AML12细胞的增殖,并且在10-7Mol/L下效果更加明显。OT促进小鼠肝脏类器官的增长,在10-7Mol/L浓度下,效果显著。4.肝脏切除的再生实验中,OT明显促进12月龄小鼠肝脏再生能力,而对2-3月龄小鼠没有明显作用。5.CCl4诱导的12月龄小鼠的急性肝损伤中,OT(0.1mg/kg)组与CCl4组相比小鼠的肝脏组织的破坏程度明显减弱,炎性细胞浸润程度降低,AST和ALT明显降低,OT改善了 CCl4诱导的这种急性肝损伤。6.与OTR的表达特征相似,在2-3月龄和24月龄小鼠的肝脏标本中自噬标记物Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ的水平,随着年龄增大,明显降低。相较对照组,OT的直接作用或经rapamycin预处理后,OT明显增加自噬标记物LC3Ⅱ/Ⅰ的比值,促进自噬流。在体实验发现OT明显提高肝脏大部切除和CCl4诱导的急性肝损伤老龄鼠肝脏组织的自噬水平,提示OT通过增强自噬水平来促进肝细胞再生,延缓肝细胞衰老。结论1.肝细胞中表达OTR,并且在人和小鼠的肝脏组织中OTR的表达以及血清中OT含量随着年龄的增加而减少。2.OT可以促进AML12细胞的增殖以及小鼠肝脏类器官的生长。3.OT可以促进老龄小鼠的肝脏再生,而对年轻小鼠没有作用。4.OT可以改善CCl4诱导的急性肝损伤。5.OT促进肝细胞自噬。
【图文】：

小鼠,年龄,不同年龄,和血

图２．不同年龄的Ｃ５７ＢＬ／６小鼠肝脏组织和人的肝脏组织（结合图ＩＤ）邋ＯＴＲ表逡逑达和血清中ＯＴ含量不同，随着年龄的增加而降低逡逑（Ａ）邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ邋检测邋２－３ｍｏｎｔｈｓ邋和邋２４ｍｏｎｔｈｓ邋正常邋Ｃ５７ＢＬ／６邋小鼠邋ＯＴＲ邋蛋白表逡逑达量。（Ｂ）邋Ｉｍａｇｅ邋Ｊ分析ＯＴＲ条带灰度值，结果显示２４邋ｍｏｎｔｈｓ小鼠ＯＴＲ的表逡逑达量与邋２－３ｍｏｎｔｈｓ邋相比显著下降。Ｖａｌｕｅ邋＝邋ｍｅａｎ土邋ＳＤ，ｎ＝４，＊＊表不与邋２－３ｍｏｎｔｈｓ逡逑正常邋Ｃ５７ＢＬ／６邋小鼠相比，尸＜０．０１。（Ｃ）邋Ｅｌｉｓａ邋检测邋２－３ｍｏｎｔｈｓ邋和邋２４ｍｏｎｔｈｓ邋正常逡逑Ｃ５７ＢＬ／６小鼠血清中ＯＴ含量，，结果说明２４ｍｏｎｔｈｓ组ＯＴ含量与２－３ｍｏｎｔｈｓ相逡逑比明显降低。＇＇／３１１＾邋＝邋１１＾１１±８０，１１５；５，＊表不与２１１１0１１１：］１３小鼠相比较，尸＜０．０５。逡逑（Ｄ邋Ｅｌｉｓａ检测不同年龄段人血清中ＯＴ的含量，结果显示人血清中ＯＴ含量随着逡逑年龄增加逐渐降低。逡逑

流程图,小鼠,大部切除,青年

图６．肝脏大部切除－肝再生模型流程图逡逑（Ａ）模拟青年小鼠和老龄鼠两个年龄状态，进行不同组的肝脏切除实验，来观逡逑察肝脏再生情况。实验周期为７天，从实验开始到小鼠取材，０Ｔ组都进行０Ｔ逡逑（Ｏ．ｌｍｇ／ｋｇ）的皮下注射。在第４天时开始进行肝脏切除手术，手术后３天（即逡逑肝脏切除后３天）对小鼠进行肝脏再生情况的检测。（Ｂ）取材时，剩余部分肝逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R575

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