外源性一氧化碳对小肠缺血再灌注大鼠多器官损伤的作用及机制探讨

发布时间：2020-03-21 21:53

【摘要】： 小肠缺血再灌注(ⅡR，intestinal ischemia-reperfusion)不仅见于肠部疾病，还多与严重创伤、大手术、失血性休克、烧伤和严重感染等过程的发生与发展相伴随，是临床常见的病理生理现象。肠缺血可以导致肠道屏障功能受损，而再灌注过程在补充能量和纠正氧供的同时，还能促使大量原存在于肠腔内的细菌和内毒素随血液循环移位，严重时能通过激发全身性炎症反应(SIRS，systemicinflammation response syndrome)而损伤远隔器官，最终导致多器官功能障碍综合征(MODS，mutiple organ dysfunction syndrome)形成。 ⅡR时MODS的发病机制现阶段尚未完全阐明。除肠道细菌和内毒素移位外，多形核中性粒细胞(PMN，polymorphonuclear neutrophil)聚集、细胞因子网络形成、细胞凋亡紊乱、氧自由基引起脂质过氧化反应、细胞内钙超载等观点也受到人们关注。如何有效地防治MODS的发生和发展一直是临床工作所关注的重要课题，但已经尝试性使用的方法都没有取得突破性进展。近年来研究发现，过去被认为是毒性气体分子的一氧化碳(CO)作为一种细胞信使分子在生物体内具有舒张血管和支气管平滑肌、抑制血小板聚集、抑制炎症反应、抗凋亡、抗增殖等多种生理学作用，在神经、呼吸、循环等生理过程和抑制急性肺损伤、脏器缺血再灌注损伤、器官移植排斥反应等病理过程中发挥着重要调节作用。CO对ⅡR所致多器官损伤是否具有防治作用且其作用机制如何，现阶段尚无报道。本研究通过建立大鼠ⅡR模型，在确定外源性应用CO安全性的基础上，观察ⅡR不同阶段应用不同浓度CO对组织超微结构、细胞因子形成、细胞凋亡等的影响，并从细胞和分子水平探讨其可能的作用机制，为临床防治ⅡR所致MODS的发生和发展提供新的参考。本研究分为三个部分：一、外源性一氧化碳对小肠缺血再灌注大鼠血中碳氧血红蛋白的影响；二、外源性一氧化碳对小肠缺血再灌注大鼠多器官损伤的防治作用；三、外源性一氧化碳对小肠缺血再灌注大鼠多器官损伤防治作用的机制探讨。 实验材料 1、实验动物：健康雄性Wistar大鼠64只，体重220～260g。 2、实验试剂和药品：标准一氧化碳气体(压力：9.0MPa，浓度：250×10~(-6)／100×10~(-6)，空气平衡)；一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒；放免法TNF-α与IL-10检测试剂盒；p38 MAPK抗体；二抗；电泳用聚丙烯酰胺及Tris、甘氨酸等。 3、实验器材：CIBA-CORNING238型血气分析仪；Detax压力监测仪；日立H-600-4型透射式电子显微镜，8800型超薄切片机，Olympus ML2000型显微镜，NIKON 80IFL-FUW-PF型荧光显微镜，GC-911-γ-放射免疫计数器；Heraus-Biofuge-PrimoR型超速低温离心机；岛津UV-260型紫外分光光度计；UP200H型组织超声匀浆器；BIO-RAD—PAC300型电泳仪(美国)；BIO-RADMiniPROTEANⅡcell型垂直电泳槽(美国)；Tanon小型转印电泳槽(上海天能公司)；GIS-2020型凝胶扫描成像分析系统：大鼠气管插管(自制)，带单向活瓣T型管(自制)；小动物手术器械等。 实验方法 一、动物模型制作 大鼠实验前禁食12h，自由饮水。采用肠系膜上动脉(SMA，SuperiorMesenteric Artery)夹闭-开放方式复制ⅡR模型。大鼠腹腔注射20％乌拉坦(1.0g·kg~(-1))麻醉，开放股静脉持续微泵输注乳酸钠林格氏液(10ml·kg~(-1)·h~(-1))。行颈动脉置管(用于测定动脉压及采血)，气管切开插管后接带单向活瓣T型管(活瓣能保证吸入气为所需气体，呼出气进入大气)，保留自主呼吸。常规消毒后取腹正中切口3～4cm，游离SMA，血压平稳10min后用显微手术用无损伤动脉夹关闭SMA起始部，造成肠缺血；缝合切口，60min后经原切口入腹腔，去除动脉夹，恢复小肠血供120min即为ⅡR模型。 二、实验分组 大鼠随机分为8组，每组8只。A组：假手术对照组，不阻断SMA，其余手术过程同其他组；B组：小肠缺血再灌注组。经T型管吸入空气。C组分为C1亚组与C2亚组，缺血前10min开始经T型管吸入浓度分别为100ppm、250ppm的CO；D组：分为D1亚组与D2亚组，再灌注开始时经T型管吸入浓度为100ppm、250ppm的CO；E组：分为E1亚组与E2亚组，再灌注60min时开始经T型管吸入浓度为100ppm、250ppm的CO。 三、观察指标和方法 1、连续监测动脉压(MAP)变化； 2、血气值及血中碳氧血红蛋白(COHb)值； 3、组织超微结构检查(电镜)； 4、组织多形核中性粒细胞(PMN)计数(光镜)； 5、组织凋亡细胞计数(TUNEL免疫荧光法)； 6、血浆TNF-α浓度(放免法)； 7、血浆IL-10浓度(放免法)； 8、组织中p38 MAPK的蛋白表达(Western blot法)。 实验结果 一、外源性CO对ⅡR大鼠血中COHb的影响 1、与A组比较，ⅡR各组再灌注后MAP均明显下降(P＜0.05)；与B组比较，应用CO各组MAP变化不明显(P＞0.05)。 2、A组各时点、B组ⅡR前后各时点COHb浓度无明显差异(P＞0.05)。 3、与B组相应时点比较，应用CO各组COHb浓度升高(P＜0.05)，且250ppm组升高更显著(P＜0.01)。与应用CO前相比，100ppm组COHb浓度升高(P＜0.05)，最高到6.8±1.2％；250ppm组COHb浓度升高显著(P＜0.01)，最高达到13.3±3.1％。 二、外源性CO对ⅡR大鼠多器官损伤的防治作用 (一)组织超微结构的变化： 1、肠：A组见正常小肠结构。B组结构受损极重，小肠上皮大量微绒毛脱落，细胞之间细胞连接松弛，细胞胞质内大部分线粒体嵴溶解；胞质有局部溶解，细胞核内异染色质边集，核胞间隙增宽。外源性应用CO各组：C1、C2两组受损较轻，虽胞质内线粒体外膜模糊不近于正常，但小肠上皮表面微绒毛部分整齐，粗面内质网仅轻度扩张；E1、E2两组受损相对较重。C、D、E组内两亚组比较无明显差异。 2、肺：A组结构基本正常。B组结构明显受损，气血屏障模糊增厚，Ⅱ型上皮细胞表面微绒毛短小稀疏，核型不规则，胞质内多个线粒体空泡变性，板层小体排空式消失；Ⅰ型上皮细胞部分破损溶解，血管内皮细胞大面积溶解，腔内见红细胞。外源性应用CO各组：C1、C2两组受损较轻，Ⅱ型细胞表面微绒毛较完整，部分线粒体完好，多个板层小体存在；而E1、E2两组受损相对较重。C、D、E组内两亚组比较无明显差异。 3、肝：A组结构基本正常。B组结构略受损，细胞核膜模糊，异染色质边集，，胞质部分溶解，部分线粒体外膜破损。外源性应用CO各组肝组织结构均受损较轻，细胞核核型较不规则，少量线粒体外膜有破损。C、D、E各组间及组内两亚组比较无明显差异。 4、肾：A组结构正常。B组结构受损轻微，仅见肾小管上皮细胞核核形不规则及存在大小不等的溶酶体和大的吞饮泡增多。肾小球足突少部分融合。外源性应用CO各组肾组织结构均接近正常，肾小管上皮微绒毛较完整、核形规则；肾小球基膜连续，薄厚较均匀，足突有局部的融合。 (二)组织中凋亡细胞计数：(个／高倍视野) 1、肠：B组可见大量凋亡细胞(52±6)。C、D、E各组明显少于B组(P＜0.01)，但多于A组(5±2)(P＜0.05)；且C组＜D组＜E组，组间有差异(P＜0.05)；各组内亚组数目有差异，1组均多于2组(P＜0.05)。 2、肺：B组可见大量凋亡细胞(32±2)。C、D、E各组明显少于B组(P＜0.01)，但多于A组(2±1) (P＜0.05)；且C组＜D组＜E组，组间有差异(P＜0.05)；各组内亚组数目有差异，1组均多于2组(P＜0.05)。 3、各组肝、肾组织中均仅见少量凋亡细胞，无明显差异。 三、外源性CO对ⅡR大鼠多器官损伤防治作用作用机制探讨 (一)组织中PMN计数：(个／高倍视野) 1、肠：B组可见大量PMN聚集(66±6)。C、D、E各组明显少于B组(P＜0.01)，但多于A组(26±2) (P＜0.05)：且C组＜D组＜E组，组间有差异(P＜0.05)；各组内亚组PMN有差异，且1组多于2组(P＜0.05)。 2、肺：B组可见较多PMN聚集(52±5)。C、D、E各组明显少于B组(P＜0.01)，但多于A组(18±2) (P＜0.05)；且C组＜D组＜E组，组间有差异(P＜0.05)；各组内亚组虽1组多于2组，但无统计学差异(P＞0.05)。 3、肝：B组可见PMN聚集(35±3)。C、D、E各组少于B组(P＜0.01)，但多于A组(13±1) (P＜0.05)；且C组＜D组＜E组，组间有差异(P＜0.05)；各组内亚组PMN有差异，且1组多于2组(P＜0.05)。 4、肾：B、C、D、E各组PMN数目均与A组无明显差异(P＞0.05)。 (二)血浆TNF-α浓度的变化：(ng／ml) 1、与对照组A组(1.15±0.04)比较，单纯ⅡR的B组TNF-α(3.15±0.05)明显升高(P＜0.05)。 2、外源性应用CO的C、D、E组TNF-α浓度均明显低于单纯ⅡR的B组(P＜0.05)，且C组＜D组＜E组(P＜0.05)。 3、C、D、E各组内亚组比较，2组均低于1组(P＜0.05)。 (三)血浆IL-10浓度的变化：(ng／ml) 1、与对照组A组(15.36±2.37)比较，单纯ⅡR的B组IL-10(23.55±4.94)升高(P＜0.05)。 2、外源性应用CO的C、D、E组IL-10浓度均明显高于单纯ⅡR的B组(P＜0.05)，且C组＞D组＞E组(P＜0.05)。 3、C、D、E各组内亚组比较，2组均高于1组(P＜0.05)。 (四)各组织中p38 MAPK蛋白的表达： 1、与对照组A组比较，单纯ⅡR的B组p38 MAPK蛋白表达升高(P＜0.05)； 2、外源性应用CO的C、D、E组p38 MAPK蛋白表达均明显高于单纯ⅡR的B组(P＜0.05)，且C组＞D组＞E组(P＜0.05)。 3、C、D、E各组内亚组比较，2组均高于1组(P＜0.05)。 结论 1、大鼠在ⅡR过程中吸入浓度为100ppm／250ppm的CO是安全的。 2、外源性CO对大鼠ⅡR所致多器官损伤具有防治作用，且浓度为250ppm的CO比100ppm的CO作用更明显；缺血前应用比缺血及再灌注后应用作用更明显。 3、外源性CO对ⅡR所致多器官损伤的防治作用可能是通过调控细胞凋亡、抑制PMN聚集、抑制TNF-α产生和促进IL-10释放实现的。 4、调节细胞内p38 MAPK表达是外源性CO防治ⅡR所致多器官损伤作用的分子生物学基础之一。
【图文】：

238士 1672士 0.156.3士 2.646.2士 5.3132士10237士 157.2士 0.054.6士 3.043.7士 5.4131士19二、各组动物MAP的变化:见表2，图1。(一)11、nl、W组:同I组相应时点比较，再灌注后的T3、几时点MAP下降显著(尸 <0.05);(二)nl、IV组:同n组相应时点比较，CO吸入后的几、几、几时点MAP变化无明显差异(P>0.05)。表2，各组动物MAP变化情况(~Hg，n二8，x士:)几几 115士1595士1290士783士8120士991士1072士965士8中 118士792士771士6，78士6*68士5121士8102士1372士4

本文编号：2593990