Tim-3抑制肝脏巨噬细胞活化减轻非酒精脂肪肝引起的肝损伤

发布时间：2020-03-24 18:30

【摘要】：研究背景及目的非酒精脂肪肝病(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)为慢性代谢性疾病,主要病理特征为肝细胞发生脂质沉积及空泡变性。在我国,NAFLD已经超越慢性乙型肝炎成为第一大慢性肝脏疾病,严重影响国民健康。随着肝细胞脂质沉积加重及炎症反应发生,约20%NAFLD患者可进展为非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)。其中,部分 NASH 患者逐渐发展为肝细胞纤维化,甚至肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)。NAFLD发病机制复杂,目前公认的主流学说为多重打击学说:在NAFLD早期肝细胞开始出现脂质沉积;随着脂质沉积增加肝细胞脂毒性破坏加重,继而诱发氧化应激,导致细胞线粒体受损、大量活性氧(reactive oxygen species,ROS)产生并触发多种炎症因子释放并加剧肝细胞损伤。众多文献证实,ROS及由其触发的炎性反应是促进NASH进展的主要因素之一。因此,寻找靶向干预ROS介导的炎症反应的关键调控分子,对于NASH临床治疗具有重要意义。肝脏内富含多种固有免疫细胞,固有免疫细胞及相关分子参与多种肝脏疾病致病过程。越来越多的研究表明,固有免疫细胞尤其是肝脏巨噬细胞在NASH疾病进展中发挥关键作用。有报道称,NASH肝内往往伴有肝巨噬细胞(枯否细胞,kuppfercell,KC)的浸润及炎性活化。KCs活化后可产生多种介质,如ROS和促炎细胞因子等,加剧NASH所诱导的肝损伤。BaeckC等证实,靶向干预趋化因子MCP-1,可有效抑制肝巨噬细胞浸润,减轻胆碱-蛋氨酸缺乏饮食(methionine-choline deficient diet,MCD)诱导的 NASH 小鼠肝损伤。所以,靶向肝脏巨噬细胞,尤其是肝巨噬细胞来源的ROS及其介导的炎症反应,有望为NASH治疗提供新策略。Tim-3(T cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3,Tim-3)最初被定义为T细胞免疫调节分子。但越来越多的证据表明,多种固有免疫细胞如NK细胞、巨噬细胞均表达Tim-3。单核细胞及巨噬细胞均组成性表达高水平的Tim-3,不同环境因素调节Tim-3表达,进而影响单核/巨噬细胞功能,参与多种疾病进展。肿瘤微环境中的TGFβ促进肿瘤相关巨噬细胞Tim-3表达,升高的Tim-3参与影响巨噬细胞极化、促进HCC发生发展。另有研究称,慢性乙型肝炎(Chronic Hepatitis B,CHB)患者外周Tim-3+CD14+单核细胞数目与患者血清谷氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)呈正相关。然而,Tim-3是否通过调控肝脏巨噬细胞功能参与NASH进展,迄今尚无文献报道。在NASH诱导的肝损伤过程中,Tim-3对巨噬细胞活化及活性氧产生是否具有调控作用,仍有待证实。本研究拟利用MCD建立NASH小鼠模型,探讨Tim-3对肝巨噬细胞的调控及其在NASH中的作用。方法与结果1.NASH小鼠肝组织Tim-3表达显著升高,敲除Tim-3明显促进NASH进展为探讨Tim-3在NASH中作用及可能的机制,我们首先利用MCD饲料、高脂饲料(High-Fat Diet,HFD)饲喂C57BL/6小鼠建立NASH小鼠模型。收集MCD饮食2W、HFD饮食24W小鼠肝组织,采用免疫组化及western blot分析肝内蛋白水平的Tim-3表达。结果表明,与正常饮食(normal diet,ND)组相比较,MCD及HFD诱导的NASH小鼠肝组织中Tim-3表达均呈现显著增加,提示Tim-3可能参与影响NASH。为进一步明确Tim-3在NASH诱导的肝损伤中的作用,利用TALEN技术构建Tim-3敲除(Tim-3KO)小鼠。分离肝脏单个核细胞,利用流式分析肝内CD45+细胞Tim-3表达,证实肝内免疫细胞来源的Tim-3敲除成功。分别对野生型(wild type,WT)及Tim-3KO小鼠进行MCD饮食,诱导NASH模型,比较两组小鼠肝脏损伤及脂质沉积情况。结果表明,与WT小鼠相比较:Tim-3KO小鼠MCD处理后血清ALT显著上调,肝组织甘油三酯(Triglyceride,TG)增加,肝细胞空泡化加剧,肝组织纤维化明显加重。以上结果证实,Tim-3减缓MCD诱导的NASH小鼠的肝脏炎性损伤。2.Tim-3在NASH小鼠肝内不同巨噬细胞亚群的表达均显著增加肝脏内的主要固有免疫细胞包括巨噬细胞、NK及NKT等,均表达较高水平的Tim-3,上述免疫细胞在NASH进展中发挥重要作用。为明确NASH小鼠肝内高水平Tim-3的主要固有免疫细胞来源,本实验收集MCD处理2W小鼠肝组织,首先采用40%percol对肝单个核进行体外分离,然后利用流式细胞术分析肝内巨噬细胞、NK及NKT细胞的比例。流式结果表明,MCD诱导的NASH模型肝脏内NKT比例显著降低,而NK及巨噬细胞比例显著升高。进一步对比两组小鼠肝内NK及巨噬细胞Tim-3表达情况,发现相比较ND组,MCD肝内NK细胞Tim-3无显著变化,而肝脏贴壁巨噬细胞Tim-3表达呈现显著上调。肝巨噬细胞为异质性细胞群,包括F4/80+CD11b+、F4/80+CD68+、F4/80+CD169+等巨噬细胞亚群。流式结果表明,MCD诱导的NASH小鼠肝脏内上述三群巨噬细胞亚群中的Tim-3表达均见显著上调。上述流式结果在HFD小鼠模型中也得到了进一步验证,HFD 24W小鼠肝内F4/80+CD11b+以及F4/80+CD68+巨噬细胞中Tim-3表达显著升高。为进一步验证人发生脂肪变的肝组织中巨噬细胞Tim-3是否高表达,收集肝癌患者癌旁组织,免疫荧光技术检测CD68+细胞Tim-3表达,结果发现,与对照相比较,发生空泡化(提示可能发生肝细胞脂质沉积)肝组织内CD68+巨噬细胞Tim-3表达明显升高。综上,Tim-3在NASH动物模型肝脏不同巨噬细胞亚群及人发生空泡化的肝组织内巨噬细胞中的表达均见显著增加,提示肝巨噬细胞为NASH肝内高水平Tim-3的主要细胞来源,在NASH中发挥作用。3.MCD肝匀浆及OA诱导巨噬细胞Tim-3高表达为明确NASH小鼠肝脏巨噬细胞表达高水平Tim-3的原因,寻找诱导Tim-3升高的组织微环境因素,制备ND及MCD饮食2周小鼠肝匀浆并分别刺激腹腔来源的巨噬细胞,体外模拟NASH肝脏内微环境对巨噬细胞刺激作用。qPCR结果显示,与ND肝匀浆刺激组相比较,MCD肝匀浆刺激后巨噬细胞Tim-3表达显著上调。与此相一致,不饱和脂肪酸油酸(oil acid,OA)刺激巨噬细胞,导致巨噬细胞发生脂质沉积,并诱导巨噬细胞Tim-3表达升高。上述结果提示OA及NASH小鼠肝脏微环境促进巨噬细胞Tim-3高表达。4.Tim-3明显抑制巨噬细胞ROS及下游炎性因子产生肝脏巨噬细胞来源的ROS在NASH中发挥重要作用,为研究Tim-3对巨噬细胞来源ROS的具体作用,本实验分别收集MCD、HFD小鼠肝脏贴壁巨噬细胞,流式检测其ROS水平,并比较WT及Tim-3KO小鼠肝组织中NADPH酶2(NOX2)的表达差异。与前期报道一致,MCD、HFD小鼠肝贴壁巨噬细胞ROS水平显著高于ND组,说明巨噬细胞来源ROS在NASH中具有重要作用。进一步收集MCD饮食2周的WT、Tim-3KO小鼠肝组织,western blot结果显示,与对照组相比,Tim-3KO小鼠肝组织NOX2表达显著增加,提示Tim-3对ROS发挥调控作用。为证实以上推论,利用Tim-3中和抗体(anti-Tim-3)阻断骨髓来源巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages,BMDM)Tim-3 通路后进行体外刺激,流式检测ROS水平。结果表明,LPS、PA刺激经anti-Tim-3预处理的BMDM后ROS水平较IgG组显著升高。上述趋势在siTim-3预处理的腹腔巨噬细胞(peritoneal macrophage,PM)中得到进一步验证。进一步利用Tim-3KO来源的BMDM及PM,同样观察到Tim-3对巨噬细胞ROS及线粒体活性氧的抑制作用。此外,相比较WT对照组,Tim-3KO小鼠来源的肝脏贴壁巨噬细胞ROS产生也明显增加。以上研究结果说明:Tim-3抑制巨噬细胞ROS产生。有文献称,ROS可诱导炎性小体活化及相关炎性因子产生。为研究Tim-3是否调控ROS介导的炎性小体活化及下游炎性分子分泌,我们对MCD处理后WT及Tim-3KO小鼠肝内炎性小体活化及下游相关分子表达进行分析,结果发现:与MCD处理的WT小鼠相比较,MCD饲喂的Tim-3KO小鼠肝内caspase-1 p20、IL-1β、IL-18表达均呈显著升高,但TNF-a表达无显著差异。同样,Western blot、RT-PCR 及 ELISA 结果表明,anti-Tim-3 预处理的 BMDM 中 caspase-1 p20表达升高、IL-1β分泌增加,提示Tim-3抑制巨噬细胞炎性小体活化及相关炎性因子产生。进一步利用ROS抑制剂NAC(N-acetylcysteine,NAC)预处理WT、Tim-3KO小鼠来源PM,流式结果显示:NAC处理后Tim-3KO对IL-1β的上调作用消失。综上结果提示,Tim-3通过负向调控ROS抑制巨噬细胞炎性小体活化及相关炎性因子释放。5.ROS抑制剂显著减缓Tim-3KO小鼠中MCD介导的肝损伤为进一步明确Tim-3抑制ROS在MCD介导肝损伤中的作用,设计NAC体内干预实验。分别给予WT及Tim-3KO小鼠150mg/kgNAC隔日腹腔注射处理,MCD饮食饲喂2周后:采集外周血分离血清检测ALT;制备肝匀浆检测TG、IL-1β以及IL-18水平;肝组织提取蛋白检测caspase-1p20;肝石蜡切片后进行HE染色观察肝细胞空泡化。结果显示,NAC及MCD处理后WT与Tim-3KO小鼠上述指标均无显著差异,提示NAC处理可以显著改善Tim-3KO导致的NASH肝损伤。结论:NASH肝脏微环境促进肝内多种巨噬细胞亚群高表达Tim-3,Tim-3显著抑制巨噬细胞ROS及下游炎性因子分泌,保护NASH引起的肝损伤。创新性和意义:本研究首次报道了 NASH个体中肝脏不同巨噬细胞显著高表达Tim-3,发现Tim-3抑制巨噬细胞ROS及其下游炎性反应,发挥减缓非酒精性脂肪肝介导肝损伤的作用。上述研究结果不仅有助于阐明免疫检查点Tim-3在NASH肝固有免疫中的作用,并且为NASH治疗提供了新靶点。
【图文】：

与ＮＤ组相比较，ＭＣＤ及ＨＦＤ处理后：ＮＡＳＨ小鼠血清ＡＬＴ明显升高（图逡逑１Ａ）；邋ＮＡＳＨ鼠肝脏外观呈现淡黄色（图ＩＢ）；邋ＨＥ结果显示ＭＣＤ及ＨＦＤ处理逡逑后肝细胞发生明显空泡化（图１Ｃ），提示肝细胞内发生脂质沉积；０Ｒ０染色结逡逑果进一步表明，与ＮＤ小鼠相比较，ＭＣＤ及ＨＦＤ处理后肝脏内脂滴沉积均明显逡逑增多（图１Ｄ）。上述结果均表明ＮＡＳＨ小鼠建模成功。逡逑Ａ逦Ｂ逡逑５００１逦１５＆］逦＊逦ＮＤ逦ＭＣＤ邋ＮＤ逦ＨＦＤ逡逑ｒ逦４■魏逦｜，

本文编号：2598684