肠道菌群紊乱对慢性胰腺炎的影响及机制研究

发布时间：2020-03-30 08:36

【摘要】：慢性胰腺炎(chronic pancreatitis,CP)是一种由遗传、环境或其它因素引起的病理性纤维炎症综合征,能够对实质损伤或应激产生持久的病理反应。目前CP病因与发病机制尚无定论。除酗酒和胆管疾病外,临床上急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)的反复发作也是导致CP发病的重要因素。目前,已有研究证明利用复合抗生素处理造成肠道菌群紊乱,敲减肠道菌群可有效缓解AP的症状。此外,与健康人群相比,CP患者的唾液与肠道微生物发现了显著变化。但微生物在CP中扮演何种角色还未可知。因此,本论文采用雨蛙素诱导的小鼠CP模型,探讨了抗生素处理造成的肠道菌群紊乱对小鼠CP的作用及可能的机制,以期为治疗或预防CP提供理论基础。将8周龄左右的雄性C57BL/6J小鼠随机分为对照组、抗生素对照组、CP模型组和抗生素处理组。在诱导慢性胰腺炎前一周,给予四组小鼠正常饮食的同时,每天给予抗生素对照组和抗生素处理组小鼠额外灌胃含有复合抗生素的蒸馏水200μL。第8天起,给予模型组和抗生素处理组小鼠腹腔注射雨蛙素(50μg/kg)四周,建立CP模型,在此期间持续抗生素处理。最后一剂雨蛙素注射后的第三天将小鼠处死,快速收集小鼠的血液和胰腺等组织样品。测定胰腺重量;采用苏木精-伊红染色观察胰腺的组织形态学变化;采用实时定量PCR测定胰腺炎症因子以及纤维化相关基因mRNA表达水平;采用蛋白免疫印迹法检测胰腺中纤维化相关蛋白、组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases,HDACs)和激活G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptors,GPCR)表达情况;采用气相色谱-质谱检测小鼠结肠粪便中短链脂肪酸(short chain fatty acids,SCFAs)的含量。实验结果表明,抗生素处理造成的肠道菌群紊乱能够加重小鼠CP,具体表现为:小鼠胰腺萎缩程度显著升高,胰腺炎症因子水平显著上升,胰腺纤维化水平显著提高。同时抗生素处理能够显著降低小鼠结肠粪便中SCFAs水平,并提高胰腺中HDAC1的表达。随后,将8周龄左右的雄性C57BL/6J小鼠随机分为对照组、CP模型组、抗生素处理组和SCFAs处理组。抗生素处理方式与CP造模方法与上述一致,SCFAs处理采取将近结肠端浓度的乙酸盐(67.5 mM)、丙酸盐(25.9 mM)、丁酸盐(40 mM)溶入小鼠饮用水中,让其自由摄取。随后采用上述方法测定小鼠胰腺重量,观察胰腺形态学变化及检测纤维化相关蛋白的表达情况。实验结果表明,抗生素处理造成肠道菌群紊乱后给予小鼠含有近端结肠浓度SCFAs的饮用水,能够有效缓解由抗生素处理引起的胰腺萎缩和纤维化,说明抗生素处理扰乱肠道菌群加重CP的原因与SCFAs的降低有关。综上,抗生素扰乱肠道菌群后显著降低了肠道代谢物SCFAs的浓度,进而降低了SCFAs对HDAC1的抑制作用并最终加剧了小鼠CP的病情。本研究首次证实了抗生素处理扰乱肠道菌群后对小鼠CP有损伤作用,为以后研究肠道菌群在疾病中的作用提供新的方向,也为临床治疗CP提供新的思路。
【图文】：

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江南大学硕士学位论文2.2 实验方法2.2.1 抗生素预处理和慢性胰腺炎模型建立将 8 周左右的雄性 C57BL/6J 小鼠随机分为四组，分别为对照组，抗生素对照组，模型组和抗生素处理组，每组 8~10 只小鼠。在诱导 CP 的前一周，给予抗生素处理组小鼠灌胃含有复合抗生素的蒸馏水 200μL，水中抗生素浓度分别为：万古霉素 0.5g/L，新霉素 1g/L，甲硝唑 1g/L，氨苄西林 1g/L[89]。其余两组给予相同体积的蒸馏水。随后建立 CP 模型。诱导 CP 最常见的方法是通过重复的腺体病理刺激造成自限性腺泡细胞损伤，本研究选用腹腔注射雨蛙素的方法建立小鼠 CP 模型。给模型组和抗生素处理组小鼠每小时腹腔注射一次雨蛙素（50 μg/kg），连续注射 6 小时。每周间隔注射 3 天，，连续注射 4 周。对照组注射等剂量生理盐水。造模期间每 2 天灌胃一次抗生素。在处死小鼠的前一天下午收集粪便，在最后一次注射雨蛙素后的第 3 天，人道处死小鼠并快速收集血液、胰腺和结肠等组织，并将其保存在-80℃超低温冰箱中。

示意图,模型,示意图,浸蜡

.2.3 胰腺组织形态学分析采用苏木精-伊红染色法观察组织形态。碱性的苏木精能够将细胞核中酸性的核为蓝紫色；而酸性的伊红能够将碱性的细胞质和细胞外基质染为红色。操作步骤大下：（1）固定：处死小鼠后将胰腺放入 4%的中性多聚甲醛中固定。根据组织质感确定时间，大致在 12~36 小时。（2）脱水、透明和浸蜡：取出固定液中的组织，流水冲洗表面多余的固定液，依过 50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇逐步进行脱水，随后将样品依次二甲苯-乙醇（1:1）和二甲苯溶液中进行透明。组织透明结束后立即放入提前融化点温度的石蜡中进行浸蜡，时间为 2~3 小时。（3）包埋：将浸蜡处理后的胰腺组织包埋，确保包埋时保持胰腺的最大切面。图 2-2 SCFAs 处理与 CP 模型示意图Fig. 2-2 Diagram for SCFAs treatment and CP model
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R576

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