乙肝病毒X蛋白对不同肝细胞系凋亡的诱导作用

发布时间：2020-04-02 09:52

【摘要】：目的：构建乙型肝炎病毒X蛋白重组质粒PEGFP-N1-HBX,脂质体方法转染入人正常肝细胞系L02细胞和人肝癌细胞系HepG2细胞,观察HBX通过核转录因子NF-κB信号通路对不同肝细胞系肝细胞凋亡的诱导作用。方法： 1.体外培养人正常肝细胞L02细胞和人肝癌细胞HepG2细胞。 2.采用脂质体转染将PEGFP-N1-HBX质粒转染至L02细胞和HepG2细胞,荧光倒置显微镜观察稳定转染后细胞中EGFP报告基因的表达,Western Blot法检测稳定转染后细胞内HBX蛋白的表达。 3.用特异性NF-κB信号通路阻断剂吡咯二硫代氨基甲酸酯(PDTC)阻断NF-κB信号通路。 4.流式细胞术检测转染前后及加入PDTC前后两细胞系的细胞周期特征与凋亡率。 5.Western Blot技术检测NF-κB的表达变化。结果： 1.稳定转染后的L02和lepG2细胞在倒置荧光显微镜下观察,转染质粒PEGFP-N1-HBX和空质粒PEGFP-N1的细胞有荧光表达；未转染的细胞未见荧光表达(图1)。 2.Western blot结果可见,稳定转染PEGFP-N1-HBX质粒的L02和HepG2细胞组有HBX蛋白表达,而其它四组空质粒及空白对照组则检测不到目的蛋白条带(图2)。 3.流式细胞术结果显示：与对照组L02细胞相比,L02/HBX细胞凋亡率明显增加,其GO/Gl期细胞比例显著增加,S期和G2/M期细胞比例明显减少。与对照组HepG2细胞相比,HepG2/HBX细胞凋亡率显著降低,其G0/Gl期细胞比例显著减少,S期和G2/M期细胞比例明显增加。PDTC作用后,L02/HBX/PDTC组较L02/HBX组凋亡率及G0/Gl期细胞比例显著增加,S期和G2/M期细胞比例明显减少,而HepG2/HBX/PDTC组较HepG2/HBX组凋亡率及G0/G1期细胞比例显著增加,S期和G2/M期细胞比例明显减少,但其凋亡率仍低于对照组HepG2细胞,差异具有显著意义(P0.05)。 4.Western Blot结果显示：L02/HBX细胞NF-κB表达显著下调,而HepG2/HBX细胞NF-κB表达显著增加,L02/HBX/PDTC和HepG2/HBX/PDTC细胞NF-κB几乎不表达。结论： 1.成功构建稳定表达HBX蛋白的转基因细胞株L02/HBX和HepG2/HBX。 2.HBX转染正常肝细胞L02后,可通过下调NF-κB蛋白的表达而阻滞细胞周期进程和促进细胞凋亡,而HBX转染肝癌细胞HepG2后,可通过增加NF-κB蛋白的表达而发挥加速细胞周期进程和抑制细胞凋亡的作用。
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R512.62

【参考文献】