H0-1基因促进紧密连接蛋白Claudin-4表达增强肠粘膜屏障抗损伤与修复的作用初步研究

发布时间：2017-03-22 11:10

  本文关键词：H0-1基因促进紧密连接蛋白Claudin-4表达增强肠粘膜屏障抗损伤与修复的作用初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的： 缺血再灌注损伤(Ischemia Reperfusion Injury, IRI)是指组织、器官缺血一段时间后,血管再通,组织器官灌注重新恢复后,细胞功能代谢障碍及结构破坏反而较缺血时进一步加重,器官功能进一步恶化的临床综合征。研究表明缺血再灌注损伤的早期变化为肠道屏障遭到破坏,肠粘膜通透性增强。上皮细胞间紧密连接是构成肠粘膜屏障的重要组成部分,能够防止肠腔内有害物质如毒素或细菌穿过肠黏膜进入体内其他组织器官和血液循环。各种原因引起的肠粘膜屏障的损害是导致机体内环境紊乱和全身性感染的扳机。因此肠屏障功能已成为判断危重病人预后的重要指标,肠道不仅是多器官功能障碍综合征(Multiple organ dysfunction syndrome, MODS)的靶器官,更是MODS的启动者。而众所周知,血红素氧化酶-1(Heme oxygenase-1, HO-1)是唯一可以被诱导的血红素氧化酶,是生物体内血红素分解的限速酶。血红素降解产生三种产物在抗氧化、细胞内外信息的传递以及维持机体内环境稳定等方面发挥重要的生理功能。研究表明HO-1及其代谢参与体内各种氧化应激及炎症反应,发挥抗炎、抗凋亡及细胞保护作用。因此有学者认为HO-1是未来治疗胃肠道疾病的重要靶点。本研究通过建立大鼠缺血再灌注损伤模型及肠粘膜屏障体外模型观察肠上皮细胞间紧密连接蛋白HO-1和Claudin-4蛋白表达的变化,以进一步揭示小肠缺血再灌注损伤的发病机制。 方法： 采用“肠系膜上动脉结扎60min法”建立大鼠肠缺血再灌注模型,构建人HO-1基因过表达载体并建立HO-1基因过表达结肠癌细胞株。动物实验对象分为为6组,分别为假手术组,肠系膜缺血后再灌注3、6、12、24、48h组,每组5只；细胞实验分为实验组Caco-pS/HO-1和空白对照组Caco-pS2。采用SYBR Green相对定量逆转录聚合酶链反应(QRT-PCR)、蛋白免疫印迹法(Western Blot)以及免疫组织化学检测缺血再灌注损伤后个时间点及过表达载体转染前后H0-1及Claudin-4mRNA及蛋白的表达水；行CCK-8细胞增殖实验和免疫荧光法观察HO-1分子在细胞内的分布情况。应用SPSS18.0统计软件对实验结果进行分析。 结果： 1.RT-PCR及Western Blot结果显示紧密连接蛋白claudin-4在缺血再灌注后3h后蛋白表达逐渐升高,于12h达到最高,随后逐渐恢复正常; 2.双酶切及双向测序证实载体构建成功,并于Caco-2细胞内WB和PT-PCR证实。免疫荧光染色后,经共聚焦显微镜观察发现,H0-1蛋白主要分布在细胞质和细胞膜; 3.CCK-8增殖实验显示：第五天对照组pS：3.2500±0.2477实验组pS/HO-1:5.4300±0.2497,与对照组相比较,实验组细胞增殖能力明显高于对照组(P0.05)。细胞划痕实验：实验组细胞于划痕后48小时划痕愈合,而对照组不愈合。48小时后,实验组、对照组细胞划痕平均宽度为分别为(17.25±7.31)vs(126.37±11.14)μ m(P0.05)。 4.HO-1过表达载体转染Caco-2细胞后,经Western Blot检测示紧密连接蛋白Claudin-4明显增加(1.04±0.15)vs(0.50±0.07)(P0.05)。 结论： 1.成功建立大鼠小肠缺血再灌注损伤动物模型； 2.成功构建HO-1基因真核过表达载体并建立HO-1基因过表达结肠癌细胞株； 3.紧密连接蛋白Claudin-4缺血再灌注损伤后先增加超出正常后恢复,有利于肠粘膜屏障抗损伤及修复; 4.HO-1基因调节紧密连接蛋白Claudin-4表达促进肠粘膜细胞增殖,增强粘膜抗损伤与修复功能。
【关键词】：HO-1基因 Claudin-4 肠粘膜屏障 缺血再灌注损伤 损伤修复
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R574
【目录】：

• 中文摘要6-8
• Abstract8-11
• 符号说明11-12
• 前言12-14
• 材料与方法14-29
• 实验结果29-31
• 讨论31-33
• 结论33-34
• 附图表34-38
• 参考文献38-40
• 综述40-48
• 参考文献44-48
• 致谢48-49
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文49-50
• 学位论文评阅及答辩情况表50

【参考文献】

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1 周君琳,凌亦凌,鲁士宝,关立,刘清河,王志伟,黄欣莉;丝裂原活化蛋白激酶在一氧化碳抗大鼠肢体缺血再灌注所致肺损伤中的作用[J];中华实验外科杂志;2005年02期

2 Eirini Pantazi;Mohamed Amine Zaouali;Mohamed Bejaoui;Emma Folch-Puy;Hassen Ben Abdennebi;Joan Roselló-Catafau;;Role of sirtuins in ischemia-reperfusion injury[J];World Journal of Gastroenterology;2013年43期

  本文关键词：H0-1基因促进紧密连接蛋白Claudin-4表达增强肠粘膜屏障抗损伤与修复的作用初步研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：261384