B基因型与C基因型乙型肝炎病毒部分生物学特性的比较

发布时间：2020-04-05 05:37

【摘要】： 目前全世界有超过3.5亿的人群感染乙型肝炎病毒(HBV),HBV感染已成为全世界共同的健康问题。HBV属于嗜肝病毒,在复制周期中含有转录过程,而逆转酶缺少校对功能,因此在复制过程中容易发生基因突变,形成不同的准种。当病毒基因组的核苷酸差异大于8%时,即形成了不同的基因型。根据HBV全基因组序列的差异,HBV被分为8种主要基因型(A-H),这8种基因型在全世界呈地域性分布,我国最常见的是基因型B和C。在临床上,HBV前C区(PC)G1896A突变和核心启动子(BCP)区A1762T／G1764A突变可分别会减弱和阻断HBeAg的表达,常见于HBeAg阴性慢性乙型肝炎(CHB)患者,但国内对HBeAg阳性CHB患者的PC区G1896A和BCP区A1762T／G1764A突变情况了解不够。与B基因型慢性HBV感染者相比,C基因型慢性HBV感染者的BCP区突变率较高,HBV活动性复制的持续时间较长,HBeAg血清学转换时间较晚,且更容易发展至终末期肝病和肝细胞肝癌(HCC)。但对直接来源于B和C基因型CHB患者的临床分离毒株的生物学特性尚缺乏系统研究。为了进一步研究HBeAg阳性CHB患者中B和C基因型的分布、PC/BCP区的变异情况及其与HBeAg水平的关系,系统比较B与C基因型CHB患者HBV临床分离株基因组复制,病毒分泌和蛋白表达等生物学特性方面的差异,我们共开展了三部分的研究工作。在第一部分工作中,我们分析了207例中国HBeAg阳性CHB患者的基因型、BCP/PC区突变与HBeAg滴度的关系。所有入选的患者都没有接受过任何抗病毒治疗。通过对HBV S基因直接PCR产物测序的方法确定患者的基因型；通过PCR-RFLP的方法确定BCP/PC区突变情况,并通过测序的方法予以证实。207例患者中,51例(24.6%)感染基因型B,其余的感染基因型C。50%的患者存在BCP区突变,43%的患者存在PC区突变,6.3%的患者存在BCP/PC区的联合突变。感染基因型B的患者平均年龄低于基因型C,男性患者比例也低于基因型C。基因型C患者的HBV DNA滴度与HBeAg滴度的平均值高于基因型B,虽然这些差别没有显著统计学意义。与基因型B相比,基因型C BCP区A1762T／G1764A突变率高,而PC区G1896A突变率低。在第二部分工作中,我们对研究HBV全基因组复制的方法进行了探索。目前采用的研究HBV病毒基因组功能的方法是：采用特定的结合在PC区DR1,DR2的引物,通过PCR的方法从患者血清标本中扩增出全长的HBV基因组,在体外构建可复制的包含1.1-2倍HBV基因组的载体。将此种1.1-2倍重组体转染肝癌细胞系后,可转录产生1.1倍HBV基因组长度的前基因组RNA(pgRNA)。但是,体外构建这样的重组体的程序非常复杂,不适合大量分析HBV临床分离株的功能。在本实验中,我们分析了HBV单体在基因组复制和蛋白表达方面的功能。用不同的限制性内切酶从不同的含HBV单体或双体的重组体上酶切释放产生的3.2 kb HBV单体,转染细胞后,在Huh7细胞中均可完整表达HBV基因组,这可能是由于线状HBV单体进入细胞后被细胞内的环化酶环化有关。如果在转染前利用T4 DNA连接酶将HBV单体环化,将会使HBV的复制能力明显增强。含有HBV单体的重组体转染后不能复制病毒基因组,但可以有效的表达病毒相关蛋白,如可被BspQI (SapI的同工酶)酶切后释放出HBV单体的重组体可以表达完整的HBV表面抗原,可被EcoRI酶切后释放出HBV单体的重组体可以表达完整的HBeAg和HBcAg。另外,本实验还发现,在使用High-Fidelityplus DNA polymerase进行全基因组扩增时,所获得的HBV全基因克隆中大约有1／3的克隆存在基因组复制或蛋白表达缺陷,为此,我们在转化时,不再挑取单个克隆,而是直接将转化产物转入LB培养基中,获得所有克隆,将克隆群转染细胞,研究整个克隆群的复制和蛋白表达,,这样可以解决由于单个克隆转染所带来的代表性差的问题。在第三部分工作中,我们采用第二部分建立的研究克隆群复制的方法,同时对15例来自美国和37例来自中国的CHB患者血清进行全基因扩增,将获得的HBV基因组构建为SphI双体(美国标本),或在体外将3.2 kb单体进行环化,获得整个克隆群(中国标本),通过Huh7细胞转染,分析HBV的RNA转录,蛋白表达／释放,基因组复制和病毒分泌等生物学特性的差异。Southern blot和Northern blot杂交时采用了B和C基因型混合探针以减少探针因素对结果造成的偏差。我们发现,B和C基因型HBV在用Western blot分析蛋白表达时存在两个不同点,首先他们的表面抗原在电泳时迁移速率不同,基因型B比基因型C的S迁移速率快,但L迁移速率慢；其次对preS2抗体的反应不同,基因型B的L、M蛋白可以与preS2 (Virogen)结合但基因型C不能。BCP区未发生A1762T／G1764A突变的基因型C precore RNA (pc RNA)和pg RNA的转录水平及相应的基因组复制水平均比基因型B低。BCP区发生A1762T／G1764A突变的基因型C转录和复制水平均明显增强,在野毒株BCP区人为的引入A1762T／G1764A双突变可以明显增强HBV的复制水平。有趣的是,大多数基因型C的病毒释放能力明显比基因型B强,目前该现象的分子机制还不是很清楚。野毒株基因型C复制能力强但病毒分泌能力弱,这也许是HBV基因型C在可以快速感染肝脏细胞,病毒活动性复制持续时间长,免疫清除期延迟及更容易发生BCP区突变的原因。
【图文】：

野毒株,标本,突变株,琼脂糖凝胶

图1.1.PCR一盯LP和PCR直接测序的方法确定PC区G1896A的突变。在RFLP方采用限制性内切酶Xagl对第二轮PCR产物进行酶切，，酶切产物在3%的琼脂糖凝胶分离，野毒株不llG一896A突变株的位置已标注，marker:Z000bp分子量人小marker;PC区突变的阳性对照;Wt:PC区突变的野毒株(!钟险)对照;卜6，从6份标本中DNA。对第一轮PCR产物改接进行测序，图中卜排的几个序列对应的是_L排图像中的3(r千“)，不116(右)一号标本。

滴度,标本,野毒株,患者

图1.2.PCR-盯LP和PCR直接测序的方法确定BCP区A1762T/G1764A的突变。1一6标和图1.1所示的6份标本属于同一批标本。在盯LP方法中，采用限制性内切酶Bcll对止轮PCR产物进行酶切，酶切产物在3%的琼脂糖凝胶中进行分离，野毒株和A1762T/G1764A突变株的位置已标注，marker:20oobp分子量人小marker;Mu:PC区变的阳性对照;Wt:PC区突变的野毒株(阴性)对照:1一6，从6份标本中酶切的DNA对第一轮PCR产物进行直接测序，图中卜排的三个序列对应的是上排图像中的2(左)，(中)，不l，4(右)号标本。1.3.4性别，年龄和BCP/PC区突变与HBeAg滴度的关系表1.3对影响HBeAg滴度的因素进行了分析，从中我们可以看出，不同别间HBeAg滴度没有显著差异;但不同年龄段HBeAg滴度是有差别的，<35岁的cHB患者的HBeAg滴度一显著高于全35岁的CHB患者的HBeAg滴度(20士87.5vs.173.7士101.9;六0.05)。进一步采用线性回归分析发现在没有BCPPc区突变的患者中，年龄和HBeAg滴度之间的回归系数是一1.651(图1.4)，
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R512.62

【参考文献】