重组人TFF2在乳酸链球菌中表达及其对实验性肠道损伤的保护作用

发布时间：2020-04-05 17:29

【摘要】：肠粘膜屏障损害对机体的影响主要通过二方面因素实现，一是肠粘膜组织和细胞结构的破坏；二是肠道内微生物及其代谢产物逸出肠外。所以，保持完整的肠粘膜结构和维护正常的肠道微生物平衡是防治肠粘膜屏障损伤的主要措施。 正常肠道菌群能适度刺激机体免疫反应，防止潜在的致病微生物过度滋生，减少肠内过多炎症介质产生，抑制粘膜免疫反应的病理性激活，因此经肠道补充益生菌有利于维持肠道微生态平衡。乳酸链球菌(简称乳链菌)被证实是安全和有效的益生菌(probiotics)，，已长期应用于临床实践。我们设想，如果能通过乳酸链球菌表达某些对肠粘膜细胞有保护作用的活性蛋白质或抗炎因子，即有利于维持肠道微生态平衡，也能达到保护肠粘膜屏障的目的，有可能为防治肠粘膜损伤提供更有效的治疗选择，近年三叶因子家族(简称三叶肽)的研究成果为此目标提供了可能性。 三叶因子家族(Trefoil Factor Family，TFF)是哺乳动物上皮细胞表达的一种小分子蛋白质，目前已发现了三种同源染色体结构，即TFF1、TFF2和TFF3。当前的研究已证明，TFF是正常的胃肠粘膜结构保护和损伤修复不可缺少的物质。因此，我们采用基因工程改建乳酸链球菌，使其表达人TFF2(human TFF2，hTFF2)，为肠道粘膜屏障的保护寻求一种新的治疗途径。 在本研究中，我们通过基因拼接技术在体外拼装了带c-myc分子标签的hTFF2融合基因(c-myc-htff2)，并将其插入pNBC1000(包含有P59启动子和USP45信号肽以及终止子，已由本实验室成功构建)信号肽下游的多克隆位点(multiple cloning site，MCS)，完成了c-myc-htff2表达载体系统的构建，再将表达载体系统连接于穿梭质粒，通过电穿孔转入乳酸链球菌1403株(LL—1403)，成
【图文】：

分别在C一myc一h吓F2和pBlueseript11sk(+)获得带BamHI和Sall粘端的克隆位点，将c一mye一h开凡通过枷优万了和asl，亚克隆于pBlueseript11sk(+)载体(如图1一3所示)，并转化大肠杆菌T0P10感受态细胞，细菌扩增后提取质粒进行酶切反应鉴定和DNA测序。3.2.1大肠杆菌感受态细胞的制备从LB平板上挑取大肠杆菌作.oc)liTopol单菌落接种于5ml液体培养基中，37℃培养过夜，吸取上述菌液1X()l理l接种量转接于10ml液体培养基，37Co，剧烈振摇(200一300甲m)1.5~Zh，至on朗约为.03~.04时

分别用天汤口I和刀口脚Hl/Sal耐NPTFFZ进行单、双酶切反应，前者形成二条带，其中一条是与目的基因片段尸，夕硬沼尸4万一c一myc一h术一etrminaotr大小相似的条带:后者只形成一条带(图1一8)，说明Sall酶切位点插入后失活，启动子上游和终止子下游二个筋al酶切位点实现了成功连接，这个结果与预期的设计完全一致。M一2M(bP)450030002000nLJO﨑八八曰UUCO，一00工工J...1
【学位授予单位】：第一军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R574

【参考文献】

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1 陈学清,王亚东,孙勇,段佑才,马高峰;体外拼装凋亡素基因[J];第一军医大学学报;2005年02期

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本文编号：2615309