幽门螺杆菌对克拉霉素耐药的分子基础

发布时间：2020-04-08 03:46

【摘要】： 目的：探讨寻找一种简便的幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H．pylori)分离、培养及保存、复苏方法，观察经过不同培养时间(3天，7天)时H．pylori菌落及镜下菌体的形态，采用一种新的细菌保存方法，观察H．pylori处于不同形态时保存1年后复苏的成功率；并采用E-test方法检测沈阳地区感染的H．pylori对4种不同抗生素，即克拉霉素、甲硝唑、阿莫西林及四环素的最低抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration，MIC)值，观察沈阳地区的H．pylori对各种抗生素的耐药情况，，并对其中筛选出的对克拉霉素耐药的H．pylori菌株，PCR法扩增其23S rRNA基因中2047-2347之间的片段，并对该片段进行序列分析，观察耐药株的耐药机制。方法：首先对有消化系统症状的患者，进行胃镜检查，对其中消化性溃疡、慢性胃炎及胃癌等病人，取胃窦粘膜1块，经快速尿素酶实验证实为比pylori感染阳性者，再取胃窦粘膜2块，无菌条件下切碎，接种于含10％新鲜脱纤维兔血的Columbia平板培养基，置于厌氧培养罐中，封盖，负压抽成真空，再灌入微需氧气体(5％O_2，10％CO_2，85％N_2)，于37℃、90％以上湿度的条件下培养3天，观察菌落形态及Gram染色后显微镜下菌体形态，并经尿素酶、氧化酶及触酶实验证实为H．pylori，取典型菌株进行传代纯培养，分别于不同培养时间(3天，7天)时，用无菌棉签将平板上的H．pylori菌株移入装有3ml灭菌脱脂奶的小瓶中，封盖，于-80℃深低温下保存。一年后，随机取出传代培养3天和7天时保存的H．pylori菌株，共8株，分别接种于Columbia血平板培养基，进行复苏。在传代培养中，取H．pylori纯菌落，用无菌生理盐水配制成浓度为1McFrand的菌悬液，用无菌棉签蘸取H．pylori菌液均匀涂布于含10%新鲜脱纤维兔血的Muel ler一Hinton培养基中，在15 分钟内将E一tset试纸条帖于培养基中央，并立即开始于37℃、微需氧条件下培养，3一5天后观察H.pylori生长情况，读取 H.pylori对不同抗生素的MIC值，判断H.pylori的耐药性，耐药标准:克拉霉素MIC值)smg几，甲硝哇Mlc)8 mg几，阿莫西林 Mlc值)Zm叭，四环素Mlc值)sm叭。在一80℃深低温下保存的H.pylori中，选出其中对克拉霉素耐药的H.pylori菌株3株， No.13(MIC smg/L)，Nol7(MIC 64 mg/L)，No22(MIC )256mg/L)，及敏感株1株，No.33(MIC 0.125mg/L)，进行复苏后，用0.01M的PBS lml将菌膜从Columbia平板上冲洗下来，冲洗液收集于1.5ml enphendoff管中，3000r/smins进行离心，取沉淀，采用酚一氯仿方法提取H.pylori的DNA。按文献报告资料设计引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成引物，上游引物序列为:5，一CTG CAT GAA TGG CGT AAC GAG一3，(与 H.Pylori 235 rRNA基因序列中2047一2067片段碱基互补)，下游引物序列为:5，一GAG CGA CCG CCC CGA TCA AAC一3，(与 H.Pylori 235 rRNA基因序列中2347一2327片段碱基互补)。PCR 循环体系共Zoul，其中包括 dd HZO(双蒸水)13.3ul，lox pCR buffer 2.5ul，dNTPS(2.SlnM)2ul，Taq酶(su/ul)0.2 ul，引物 (1:sx)1.5ul，DNA Sajnple 0.5 ul.PCR循环条件为:94oC4分钟，94℃40秒，61.5℃1分钟，72℃1分钟，72℃7分钟，共进行 32个循环，扩增产物跑870聚丙烯酸胺凝胶电泳，观察PCR产物纯度。选择电泳条带单一而明亮的样品，按上述条件扩增SOul，将含有PCR扩增产物的enphendoff管装入冰盒中，送交上海生工生物工程技术服务有限公司，进行序列分析，比较耐药菌与敏感菌的235 rRNA基因中目的片断的序列，以确定与耐药有关的突变情况。结果:1.H.pylori菌落为针尖状，半透明，原代培养中菌落稀少，不融合。GraJIn染色后，镜下(1000x) H.pylori在不同培养时间分别呈现不同形态，如弯曲状、杆状或短棒状、球状，将后二者重新传至新鲜培养基后，形态可恢复至弯曲状或杆状。1年后，随机取出培养3天时于脱脂奶中深低温保存的6株H.Pylori，均复苏成功;而培养7天时即球形体时保存的菌株未能复苏成功。复苏的H.pylori菌落大小、形态一致，且较密集，呈半融合状态。镜下观察H.pylori菌体为弯曲状或杆状，少数H.pylori菌体变长，更加弯曲，类似丝状。 2.30例H.pylori菌株中有7例对克拉霉素耐药(MICS在 8一256mg/ml)，耐药率为23，3ry0;12例对甲硝哩耐药(MICS在24- 256mg/ml)，耐药率为4Oyo;O例对阿莫西林耐药，耐药率为O%，2 例对四环素耐药(MIC分别为16mg/ml和32mg/ml)，耐药率为6.7%。 3.PCR扩增产物为30lbp的核普酸片断，电泳图谱提示反应体系中只含有单一的目的片断，无污染、无杂带。No.33为克拉霉素敏感H.pylori菌株，No.13、17、22分别为低度、中度及高度克拉霉素耐药的H.pylori菌株。从基因测序图谱中可以发现: 敏感株No.33共测出278个碱基，与敏感菌(No.33)序列比较， No.13(低度耐药株)共测出279个碱基，其中存在一个突变位点，即2289位点T变成了C(T2289C)，No.17(中度耐药株)共测出 278个碱基，其中存在2个突变位点，即G2224A、T2289C，No.22 (高度耐药株)共测出278
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2002
【分类号】：R57

【引证文献】