胰岛素样生长因子1调节胃肠平滑肌细胞合成干细胞因子的相关机制的初步探讨

发布时间：2020-04-08 20:49

【摘要】： 胃肠动力障碍性疾病是一类常见的消化道疾病,其中糖尿病(diabetes mellitus,DM)相关的胃肠动力障碍最常见,包括糖尿病胃轻瘫(Diabetic gastroparesis,DGP)及结肠动力障碍,严重影响患者的生活质量和血糖的控制,机制不清。研究证实Cajal间质细胞(Interstitial cell of Cajal,ICC)的结构与功能异常在DM胃肠动力障碍中有重要作用;又发现DM动物胃肠干细胞因子(Stem cell factor,SCF)与ICC病变密切有关,给予外源性SCF可改善或逆转DM小鼠ICC病变及相关的胃肠运动障碍;另有研究发现外源性胰岛素样生长因子1(Insulin-like growth factor 1,IGF-1)对ICC具有保护作用,推测IGF-1可能通过胃肠平滑肌细胞(Smooth muscle cell,SMC)调控SCF的合成,间接影响ICC的存活。本研究从细胞水平探讨IGF-1对胃肠SMC表达SCF的影响,并初步探讨其分子机制。 [目的] 1.探讨IGF-1对胃肠SMC合成SCF的影响。 2.探讨IGF-1Rα抗体对胃肠SMC合成SCF的影响。 3.探讨IGF-1调节胃肠SMC合成SCF的分子机制。 [方法] 1.大鼠胃和结肠SMC分离、培养与鉴定:正常SD大鼠断椎处死,无菌条件下取胃和结肠组织、酶解法分离胃和结肠SMC。用含10%胎牛血清的DMEM液进行胃、结肠SMC的原代培养及传代、α-actin免疫荧光法鉴定。 2.大鼠胃和结肠SMC+IGF-1:①不同浓度IGF-1(0,5,10,50,100,150μg/L)培养16h;②100μg/L的IGF-1培养不同时间(0h,8h,16h,24h,48h)。以Western blot法、RT-PCR法检测SMC中SCF的变化。 3.胃和结肠SMC同时加入IGF-1(100μg/L)和不同浓度的IGF-1Rα抗体(0,50,100,150μg/L)培养16h。Western blot法、RT-PCR法检测SMC中SCF的变化。 4.用PI3K抑制剂LY-294002、MEK1抑制剂PD98059分别预处理胃和结肠SMC1h后,再加入IGF-1(100μg/L)诱导16h。Western blot法、RT-PCR法检测SMC中SCF的变化。 [结果] 1.大鼠胃和结肠SMC培养和鉴定:SMC培养24h后,可见SMC贴壁,呈三角形或梭形,有少量突起;3-5d后SMC开始增殖;14d后SMC密集,呈峰谷样生长。α-actin免疫荧光阳性反应:大部分多角形细胞胞浆内见红色荧光,细胞核Hoechst染色呈蓝色。 2.不同浓度IGF-1对胃和结肠SMC表达SCF的影响:胃肠SMC在无血清培养时,SCF蛋白和mRNA表达较少。低浓度IGF-1(5,10μg/L)对SMC中SCF蛋白和mRNA表达无影响(P0.05),IGF-1在50μg/L时,SCF表达增加(P0.05),在100μg/L时表达最多(P0.05),150μg/L时结果类似100μg/L。 3.IGF-1作用时间对胃和结肠SMC表达SCF的影响:IGF-1在100μg/L时,促进SMC内SCF蛋白和mRNA的表达呈时间依赖性升高,16h达最高(P0.05),此后逐渐下降;48h与0h对SCF作用无统计学差异(P0.05)。 4.不同浓度的IGF-1Rα抗体对IGF-1诱导SCF的影响:加入IGF-1(100μg/L)与不同浓度的IGF-1Rα抗体后,随抗体浓度的增高,SCF蛋白和mRNA的表达愈加减少,各浓度组之间有统计学差异(P0.05)。 5.PD-98059和LY-294002对IGF-1诱导的SCF蛋白及mRNA的影响:经过PD-98059预处理后,加入IGF-1(100μg/L),能显著抑制SCF蛋白和mRNA表达(P0.05)。经过LY-294002预处理后,加入IGF-1(100μg/L),对SCF蛋白和mRNA表达无影响(P0.05)。 [结论] 1.IGF-1能诱导胃和结肠SMC中SCF表达增加,并具有时间、剂量依赖性。离体实验中100μg/L可能是IGF-1促进胃肠SMC合成SCF的有效终浓度,且诱导16小时使SCF合成达到高峰。 2.IGF-1Rα抗体可抑制胃和结肠SMC中SCF的合成,抑制作用呈浓度依赖性。 3.IGF-1诱导SCF的表达可能依赖于ERKMAPK信号传导通路。
【图文】：

结肠,倒置显微镜,免疫荧光

（一）胃和结肠SMC培养和免疫荧光鉴定1．细胞形态学：倒置显微镜下，胃和结肠SMC培养24h后，可见细胞贴壁，呈三角形或梭形，有少量突起；3～5d细胞开始增殖（见图1）；14d后细胞密集，，呈峰谷样生长（见图2）。2．细胞免疫荧光法：大部分多角形细胞胞浆内见红色荧光，α-actin 免疫荧光阳性反应，细胞核 Hoechst 染色呈蓝色（见图 3）。1 2图 1 胃和结肠 SMC 培养 3-5 天（倒置显微镜×100）注：1. 胃 SMC；2. 结肠 SMC

结肠,倒置显微镜

1．细胞形态学：倒置显微镜下，胃和结肠SMC培养24h后，可见细胞贴壁，呈三角形或梭形，有少量突起；3～5d细胞开始增殖（见图1）；14d后细胞密集，呈峰谷样生长（见图2）。2．细胞免疫荧光法：大部分多角形细胞胞浆内见红色荧光，α-actin 免疫荧光阳性反应，细胞核 Hoechst 染色呈蓝色（见图 3）。1 2图 1 胃和结肠 SMC 培养 3-5 天（倒置显微镜×100）注：1. 胃 SMC；2. 结肠 SMC
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R57

【参考文献】