PD-1抑制剂对TNBS诱导肠炎小鼠肠道菌群及肠屏障作用的初步研究

发布时间：2020-04-12 11:23

【摘要】：研究背景与目的:炎症性肠病(Inflammatory bowel diease,IBD)是一种病因尚未明的慢性非特异性肠道炎症性疾病,包括溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)和克罗恩病(Crohn’disease,CD)。一般认为该疾病由遗传易感性、免疫紊乱、肠屏障障碍以及肠道菌群失衡等多因素所致。临床表现为腹痛、腹泻和血便等,病程慢性持续、反复发作,随着环境、饮食习惯、工作压力等变化,该疾病逐年上升,已成为全球性疾病,对社会经济产生重大影响。肠上皮屏障功能缺陷是介导IBD发生发展的重要因素,而紧密连接被认为是肠上皮屏障的结构基础,紧密连接主要由膜周蛋白ZO、跨膜蛋白Occludin、Claudin和调节蛋白等组成。该结构基础的破坏会导致肠上皮通透性增加,引发黏膜免疫应答紊乱和慢性肠炎。生理条件下,人体肠道中存在大量细菌及其代谢产物,凭借肠上皮机械屏障、粘膜免疫系统及粘液屏障等调控作用,维持肠道内环境的稳定。很多研究表明,肠道粘膜免疫对肠道菌群起着重要的调控作用。调节肠道菌群可以在一定程度上缓解患者症状,减轻粘膜炎症。免疫抑制剂的应用也是激素依赖型IBD患者的重要治疗手段。程序性死亡受体-1(PD-1)是一类重要的免疫负性调控分子(也称“免疫卡控点分子”),通过与细胞表面的程序性死亡受体配体-1(PD-L1)结合,传递负性调控信号,抑制免疫细胞的活化。近年,抗PD-1和抗PD-L1抗体已经成为肿瘤免疫治疗研究中的热点。然而,PD-1/PD-L1抗体疗效却深受肿瘤微环境及肠道菌群的影响。如双歧杆菌属菌株或促进PD-1/PD-L1单抗药物的疗效等,然而PD-1/PDL-1在IBD领域研究较少,其是否可以影响肠道菌群对IBD产生作用更不得而知。因此,我们通过构建TNBS诱导的小鼠肠炎模型,利用PD-1抑制剂(G4C2)特异性阻断PD-1/PD-L1通路,观察PD-1抑制剂对IBD的作用及对肠道菌群和肠黏膜屏障的影响,为IBD的诊治提供一定的实验数据和理论基础。方法:临床研究:采集临床UC和CD患者及健康志愿者肠粘膜组织,用免疫组化方法检测PD-L1蛋白的表达量。动物实验:48只BALB/c小鼠分为正常对照组、TNBS模型组、TNBS+5-ASA组、TNBS+PD-1 inhibitor组。造模当天TNBS模型组、TNBS+5-ASA组、TNBS+PD-1 inhibitor组麻醉后予25mg/ml TNBS乙醇溶液灌肠建模,正常对照组予50%乙醇溶液灌肠。造模24h后每天给药,TNBS+5-ASA组予5-氨基水杨酸悬液灌胃,TNBS+PD-1 inhibitor组予PD-1抑制剂腹腔注射,正常对照组和TNBS模型组予PBS灌胃;每天记录小鼠体重、大便性状和隐血情况计算DAI评分。实验终点分离测量结肠长度,观察结肠损伤程度;结肠组织石蜡包埋行HE染色观察炎症情况;ELISA检测血液和肠组织相关细胞因子表达水平;采集实验终点前小鼠粪便,利用微生物组16s高通量测序分析小鼠粪便菌群的变化;采用麻醉、结扎肠段、FITC-Dextran保留灌肠30min后取血清测荧光强度评估肠壁通透性;组织免疫荧光及免疫组化观察肠屏障紧密连接蛋白的变化;最后综合相关指标进行统计学分析。结果:1.临床IBD患者肠组织PD-L1蛋白表达增高我们通过选取UC、CD和健康志愿者各10例肠黏膜标本,进行免疫组织化学染色检测PD-L1表达情况,结果发现,和健康志愿者相比,UC患者和CD患者肠黏膜PD-L1蛋白表达增高。2.PD-1抑制剂可能有助于改善TNBS诱导肠炎小鼠一般情况及疾病活动度疾病活动指数(DAI):实验第7天,TNBS模型组vs正常对照组的DAI积分显著增加(P0.05),TNBS+5-ASA组、TNBS+PD-1 inhibitor组和正常对照组DAI积分均低于TNBS模型组。结肠大体情况:结肠长度:TNBS模型组vs正常对照组缩短,TNBS+5-ASA组和TNBS+PD-1 inhibitor组vs正常对照组无显著差异;结肠大体损伤评分:TNBS+5-ASA组和TNBS+PD-1 inhibitor组均小于TNBS模型组。3.PD-1抑制剂可能有助于改善TNBS诱导的小鼠肠炎炎症水平结肠HE染色:TNBS模型组可见黏膜溃疡、水肿、增生、大量炎细胞浸润;TNBS+5-ASA组和TNBS+PD-1 inhibitor组存在不同程度溃疡,炎细胞浸润、黏膜增生及水肿,但程度相较TNBS模型组明显改善。血清TNF-α含量:TNBS模型组血清TNF-α高于正常对照组,TNBS+5-ASA组和TNBS+PD-1 inhibitor组低于TNBS模型组,其中TNBS+PD-1 inhibitor组较TNBS模型组明显下降,差异有统计学意义(P0.05),其余各组间统计学上未见显著差异。4.PD-1抑制剂可能有助于改善TNBS诱导的小鼠肠道菌群紊乱,上调菌群多样性,调整菌群结构,增加产短链脂肪酸细菌和粘膜免疫相关细菌丰度1)α多样性分析:TNBS模型组较正常对照组α多样性下降趋势明显,TNBS+5-ASA组和TNBS+PD-1 inhibitor组较TNBS模型组α多样性有显著上升趋势。2)β多样性分析:PCA分析和Uni Frac多样品相似度分析显示,正常对照组与TNBS模型组肠道菌群结构差异明显,TNBS+5-ASA组和TNBS+PD-1inhibitor组菌群结构趋近;PD-1 inhibitor干预后TNBS诱导肠炎小鼠肠道菌群中厚壁菌门(Firmicutes)丰度上升,变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)丰度下降,该菌群改变与阳性对照组ASA组改变趋势一致。3)门水平菌群结构变化:PD-1 inhibitor干预后Firmicutes和Deferribacteres门增高,Proteobacteria、Actinobacteria、Tenericutes和Bacteroidetes门减少。纲水平菌群结构变化:PD-1 inhibitor干预后Clostridia纲增加,Bacteroidia、Mollicutes、Erysipelotrichia、Alphaproteobacteria、Bacilli和unidentified Antinobacteria纲减少。目水平菌群结构变化:PD-1 inhibitor干预后Clostridiales目增加,Bacteroidales、Erysipelotrichales、Pseudomonadales、Rhodospirillales、Bifidobacteriales和Mollicutes-RF9目减少。科水平菌群结构变化:PD-1 inhibitor干预后Rikenellaceae、Lachnospiraceae、Clostridiales-vadin BB60-group、Peptococcaceae和Ruminococcaceae科增加,Christensenellaceae、Prevotellaceae、Aerococcaceae、Rhodospirllaceae、Streptococcaceae、Moraxellaceae、Bacteroidaceae、Family-XII、Clostridiaceae和Erysipelotrichaceae科减少。属水平菌群结构变化:PD-1 inhibitor干预后Butyricicoccus、Ruminiclostridum、Ruminiclostridum-9、Oscillibacter、Ruminiclostridum-5、Rikenella、Roseburia、Ruminococcaceae、Anaerotruncus和unidentified Lachnospiraceae属增加,Acinetobacter、Bacteroides、Parabacteroides和Alloprevotella属减少。种水平菌群结构变化:PD-1 inhibitor干预后Escherichia-coli、Bacteroides acidifaciens、Lachnospiraceae bacterium-COE1和Clostridium leptum菌增加,Acinetobacter baumannii和Bacteroides sartorii菌减少。其中Lachnospiraceae、Rikenellaceae、Ruminococcaceae、Butyricicoccusand Roseburia是肠道共生菌中重要的产短链脂肪酸细菌;Bacteroides acidifaciens和Clostridium leptum参与肠粘膜免疫耐受形成。4)Biomarker生物标记物和OTU水平差异种属:Biomarker生物标记物显示PD-1 inhibitor能下调TNBS诱导肠炎小鼠菌群中Alloprevotella菌的相对丰度;基于Meta Stat方法分析显示,PD-1 inhibitor干预后Deferribacteres、Clostridium_sensu_stricto_1、Empedobacter和Mucispirillum菌相对丰度增加。其中Mucispirillum证实与T细胞依赖性Ig A分泌明显相关。5.PD-1抑制剂一定程度上能改善TNBS诱导的小鼠肠炎屏障缺陷结肠组织切片免疫荧光:TNBS建模后结肠ZO-1表达量下降,经5-ASA和PD-1 inhibitor干预后结肠ZO-1表达上调。免疫组化:TNBS建模后结肠ZO-1和Occludin表达量下降,经5-ASA和PD-1 inhibitor干预后结肠ZO-1和Occludin表达上调血清FITC荧光强度:TNBS模型组血清荧光强度高于正常对照组,TNBS+5-ASA组和TNBS+PD-1 inhibitor组低于TNBS模型组。结论:1.IBD患者肠粘膜PD-L1蛋白表达增高;2.PD-1抑制剂可能有助于缓解TNBS诱导的肠炎小鼠的肠道炎症及疾病活动度;3.PD-1抑制剂可能有助于改善TNBS诱导的肠炎小鼠的肠道菌群,上调肠道菌群多样性,调整菌群结构,增加产短链脂肪酸细菌和粘膜免疫相关细菌丰度;4.PD-1抑制剂可能有助于改善TNBS诱导的肠炎小鼠的屏障缺陷。
【图文】：

患者,石蜡切片,粘膜,免疫组化

图 2 人肠粘膜石蜡切片标本免疫组化（A：健康对照；B：UC 患者；C：CD 患者）2. PD-1 抑制剂可能有助于改善 TNBS 诱导肠炎小鼠一般情况及疾病活动度2.1 小鼠体重变化本实验于实验第 2 天行 TNBS 灌肠建模（正常对照组予 50%乙醇溶液灌肠对照），建模前禁食 24h，故各组小鼠体重下降，实验第 3 天至实验终点，TNBS组体重持续下降，正常对照组体重未见明显改变，TNBS+5-ASA 组和 TNBS+PD-1inhibitor 组体重平缓上升，实验终点时，，正常对照组、TNBS+5-ASA 组和 TNBS+PD-1 inhibitor 组三组体重未见明显差异；TNBS 组体重明显低于另外三组体重，差异有统计学意义（P＜0.05）。提示 PD-1 inhibitor 可以缓解 TNBS 造成小鼠的体重下降。（表 5，图 3）。

曲线,曲线,积分,建模

图 3 小鼠体重曲线（g）.2 小鼠疾病活动度系数（DAI）建模后 TNBS 组 DAI 积分均高于正常对照组，建模第 5 天，TNBS 组NBS+5-ASA 组和 TNBS+ PD-1 inhibitor 组 DAI 积分均高于正常对照组，具计学差异（P＜0.05），但根据各组均数及标准差数据，TNBS+ PD-1 inhib和 TNBS+5-ASA 组 DAI 积分从建模 2 天后开始，均低于 TNBS 组，具有统差异（P＜0.05），且 PD-1 inhibitor 干预后 DAI 积分下降趋势比于 5-ASA更明显。（表 6，图 4）
【学位授予单位】：广州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R574.62

【参考文献】