肝纤维化恢复期Kuffer cell对HSC凋亡的调控作用及信号转导机制研究

发布时间：2020-04-17 23:28

【摘要】： 肝纤维化是肝脏对慢性损伤的一种修复反应,是一种渐进的病理过程,以细胞外基质(extracellular matrix,ECM)增生为特征。近年来的研究表明,相对进展期的肝纤维化在去除了损伤因素后是可逆的,而在肝纤维化逆转这一过程中起关键作用的是肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)的凋亡,因此,诱导肝星状细胞凋亡成为阻止肝纤维化进程的途径之一。研究显示在肝纤维化形成及恢复阶段,枯否细胞(kupffer cell,KC)发挥了双刃剑的作用。在肝纤维化进展期可促进HSC的激活,促进肝纤维化的形成;在肝纤维化恢复期,KC及活化的HSC可通过表达肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor related apoptosis inducingligand,TRAIL)及其他凋亡刺激因子从而促进HSC的凋亡,促进ECM的降解,从而抑制肝纤维化的形成。鉴于HSC在肝纤维化发病中的重要作用及KC对HSC可能具有的双向调节作用,本研究拟选用CCl_4诱导的自愈性肝纤维化模型,研究KC在肝纤维化恢复期的促HSC凋亡作用,探讨其主要发挥作用的细胞因子TRAIL可能的HSC内信号传导通路以及来氟米特(leflunomide,Lef)对该通路的影响。研究内容主要包括以下三个部分: 1.确定肝纤维化病程的进展期和恢复期分期在分别建立的8w、12w和16w由CCl_4诱导的自愈性肝纤维化模型上,经动态观察肝脏的病理组织学改变,结合能够敏感反应肝纤维化程度的血清学指标(HA,HA,LN,PCⅢ,CⅣ)和组织学指标—组织羟脯氨酸含量(Hydroxyproline,Hyp)的变化,初步确定CCl_4诱导大鼠肝纤维化模型的进展期和恢复期:进展期为模型12w,恢复期为12w模型恢复4w。 TUNEL和α-SMA双重染色显示,随着HSC的活化,HSC出现自发性凋亡,且凋亡的发生随激活进程而逐渐增加;而在肝纤维化恢复时期,随着恢复时间的延长,HSC的凋亡逐渐减少。提示由于HSC总数减少,HSC凋亡比例亦随之减少,表明活化HSC主要通过凋亡来终结其活化。RT-PCR结果表明,伴随活化HSC的凋亡,TIMP-1的mRNA的表达减少,而MMP_(13)的mRNA的表达随恢复时间的延长没有明显改变,始终维持在一个较高的水平。提示TIMPs表达水平的下降,解除了其对MMPs的抑制作用,使MMPs的活性增加,胶原分解增加,促使已形成的ECM降解,从而逆转肝纤维化。 2.探讨肝纤维化恢复期TRAIL的HSC内信号转导通路 TRAIL是肿瘤坏死因子家族成员中继肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)、FasL之后发现的第三个凋亡分子,其与细胞膜TRAIL受体结合从而发挥生物学作用。现已发现5种TRAIL受体,其中TRAIL-R1/DR4与TRAIL-R2/DR5含有死亡域,与TRAIL结合可诱导细胞凋亡。TRAIL-R3/DcR1、TRAIL-R3/DcR2及OGP不含死亡域,与TRAIL结合不能诱导细胞凋亡。同时人肝细胞表面几乎不表达TRAIL-R2/DR5受体,因此,TRAIL选择性诱导HSC凋亡的作用使其在肝纤维化的治疗中具有广阔的应用前景。本研究采用Western-blot检测肝纤维化不同时期KC中TRAIL及HSC中TRAIL-R的表达及α-SMA和TRAIL-R2免疫荧光双染结果发现,活化的HSC表达DR4和DR5,静止的HSC表达DcR1和DcR2。将不同时期HSC和KC共培养发现,KC通过TRAIL经DR5诱导共培养体系中HSC的凋亡,且活化的HSC对TRAIL介导的凋亡更加敏感。将外源性寡聚化的FLAG-TRAIL预处理恢复期的HSC发现,在肝纤维化恢复期TRAIL经线粒体通路诱导HSC凋亡。上述结果提示,在肝纤维化恢复期,KC可通过TRAIL经DR5死亡受体通过线粒体途径介导HSC的凋亡。 3.探讨肝纤维化恢复期Lef对HSC内TRAIL信号转导通路的影响 HSC的激活、增殖是肝纤维化发生的一个中心环节,然而诱导或促进激活的HSC凋亡可避免或减少HSC聚积,这也可能成为抗肝纤维化治疗的重要对策之一。本研究显示,Lef活性代谢物,A771726(0.01,0.1和1μmol/L)预处理可明显促进肝纤维化恢复期HSC的凋亡。进一步研究发现A771726通过下调c-FLIP及RIP的表达,活化凋亡发生的死亡受体通路及上调Bid的表达,激活线粒体通路来诱导活化的HSC凋亡。以上实验结果综合说明了诱导HSC凋亡是来氟米特在肝纤维化治疗中的又一个作用机制。
【图文】：

肝组织

图.2.肝组织切片Masson染色(Massonxloo)Fig.2.ofliversectionsstainedwithMasson，5triehrome(originmagnlfieationx100).A:Control;B:Medel(sw);C:Medel(12w):D:Model(16w);E:4wspon加LneousreeoveryafterinjectingCCI;12w;F:swsPontaneousreeoveryafterinjectingCCI;12w47

免疫组织化学,肝组织

安徽医科大学博士学位论文4.1.5肝纤维化不同时期价SMA阳性HSC细胞的变化a一sMA阳性是Hsc活化的标志[361，正常大鼠肝窦内无a一sMA阳性表达细胞CC玩攻击sw的大鼠肝窦内a一SMA阳性表达细胞明显增多(尸<0.01)，主要分于纤维间隔内;12w大鼠肝组织中a一SMA呈强阳性表达，阳性细胞密布于汇管纤维间隔和炎性细胞浸润区。12w的模型大鼠停止注射CCh恢复4w和sw后a一SMA阳性细胞明显减少(尸<0.01)，在汇管区的动、静脉壁，，肝窦处散在表。SMA阳性细胞记数方法:每张切片选取30个高倍视野(‘40)，记数a一sMA阳细胞总数。见图3，4o
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R575.2

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