化学性肝损伤及肝癌的代谢组学研究

发布时间：2020-04-18 00:43

【摘要】： 肝脏是机体最重要的代谢器官之一,而化学性肝损伤是引发多种肝脏疾病的重要始动环节。因此,针对化学性肝损伤的发病机制以及药物干预效应的研究,对慢性肝病的防治具有十分重要的意义。动物实验是研究化学诱导急性肝损伤发病机制的必经之路,在研究肝脏疾病发病机制及抗肝脏疾病药物的过程中,选择有科学性、实用性、重现性的肝损伤动物模型的意义亦十分重要。在肝损伤的实验研究中,四氯化碳(CCl4)诱导的化学性肝损伤和酒精性肝损伤模型是比较常见的两种动物模型。本课题将利用建立的代谢组学方法,分别对两种肝损伤模型动物的代谢特征开展研究,并利用代谢组学方法对药物干预效应进行评价。同时,在动物模型研究的基础上,本课题进一步尝试利用代谢组学方法,对临床原发性肝癌(PLC)患者的代谢特征进行分析,探索将代谢组学方法应用于临床疾病机制研究的新思路。本课题首先建立了基于色谱质谱联用技术的肝组织的代谢组学研究方法。在此基础上,重点考察了CCl4及酒精诱导的急性肝损伤大鼠尿液及肝组织的代谢谱变化,并从代谢水平观察甘利欣对CCl4诱导化学性肝损伤的保护作用及其机制。同时,在整体代谢水平上分析了临床肝癌病人与正常对照人群的代谢谱差异。本课题的主要内容和结果如下: 1.建立了基于氯甲酸乙酯衍生化(ECF)的气相色谱质谱联用(GC/MS)分析以及基于三甲基硅烷(TMS)衍生的气相色谱飞行时间质谱(GC/TOFMS)分析的肝组织代谢组学研究方法。针对前者的分析特点,采用高氯酸乙醇两步提取法提取肝组织中的小分子内源性代谢物,后者采用氯仿/甲醇/水的混合溶剂进行两步提取。两种分析方法均经方法学验证表明重复性好、灵敏度高、精密度高,适用于肝组织的快速、高通量检测。 2.采用ECF衍生、GC/MS分析的代谢组学研究方法,尝试着从整体代谢水平上考察大鼠在CCl4诱导急性肝损伤过程中尿液及肝组织中内源性小分子代谢物谱的变化,并观察甘利欣预防性给药对CCl4诱导急性肝损伤的保护作用。结合多维统计方法,发现肝损伤大鼠尿液和肝组织样本中小分子内源性代谢物发生了明显变化,并找到使得正常组和模型组区分开的相关差异性代谢物,且尿液和肝组织样本代谢谱所提供的信息相互补充,经初步分析CCl4诱导的急性肝损伤与三羧酸循环、部分氨基酸代谢等高度相关。 3.以酒精诱导的大鼠急性肝损伤模型为研究对象,采用ECF衍生、GC/MS分析的代谢组学研究方法检测了大鼠尿液及肝组织中内源性小分子代谢物谱的模式变化情况,结果发现蛋氨酸代谢、三羧酸循环及脂肪酸代谢等代谢通路变化与酒精诱导的急性肝损伤密切相关。且模型组大鼠尿液及肝组织中部分代谢物的变化趋势与CCl4诱导的急性肝损伤大鼠的相类似。 4.分别采用ECF衍生尿液的GC/MS及TMS衍生血清的GC/TOFMS方法,对肝癌患者和正常对照人群的尿液及血液进行代谢组学研究,尝试为肝癌诊断以及肝癌的病理机制理解寻找新的切入点。研究结果发现,正常人与肝癌患者尿液和血液的代谢谱均有分离趋势,进一步利用监督的正交偏最小方差判别分析(OPLS-DA)方法能清晰地观察到肝癌患者与正常对照之间尿液和血液代谢轮廓的差异,通过对代谢网络变化的分析发现了与肝癌临床病理相关的代谢通路能量代谢、苯丙氨酸、色氨酸、糖代谢以及一些其它的氨基酸代谢的变化。本课题在建立肝组织代谢组学方法的基础上,应用传统药理学指标与代谢组学研究所揭示的生物化学变化相结合的方法,为CCl4及酒精诱导的大鼠急性肝损伤的机制研究及药物药效作用的整体评价提供新的思路和视野;并且发现代谢组学技术在肝癌的早期诊断甚至分期上有很大的潜力,可以为临床诊断提供科学依据,非常值得进行深入一步的研究。
【图文】：

色谱图,肝组织,总离子流,色谱图

32图 2-1 不同提取方案对肝组织提取的总离子流色谱图Fig. 2-1 Typical GC/MS total ion current (TIC) chromatograms of liver tissue samples extractedby different solvents.2.4.2 氯仿/甲醇/水提取效果采用氯甲酸乙酯衍生方法分析肝组织，得到的代谢物大部分是氨基酸、游离脂肪酸和一些小分子有机酸类，为了检测到更多的物质如糖类、嘧啶及腺苷等，

色谱图,硅烷化衍生,总离子流,试验条件

综合分析前面所考察的氯仿/甲醇/水提取方法，主要以水和有机相、以及有机相中氯仿和甲醇的配比为考察对象。将经过不同提取条件所得的代谢物经衍生化后分析比较发现，其中 3，11，12，14，15，17 号进样瓶中有大量沉淀，导致无法进样，通过对比发现这 6 个试验条件中提取溶剂均为水：有机相>2：3（有机相体积为氯仿和甲醇的体积和），猜测可能的原因是提取溶剂中水含量太多，以致蛋白质沉淀不完全。同时还发现：当提取溶剂中氯仿过多时（氯仿：甲醇>2：3），，提取溶剂发生分层，且组织沉淀物聚集在中间层，不利于操作（取下层液体），本试验中不考虑这种方法。接下来比较表 2-4 中实验编号分别为 1，9，4，2，13 试验条件所得的总离子流色谱图（图 2-2）。从图 2-2 中观察到，当水在混合溶剂中所占的比例过大时（如 1 和 9 中），则发现保留时间为 17min 和 27.5min 左右的糖峰过大，掩盖了许多较小的峰。因此，为了避免糖峰的干扰，将水和有机相之间的比例缩小到0～1：3。1
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R575;R735.7

【引证文献】