神经介素U及其受体1在炎症性肠病中的作用及其机制研究

发布时间：2020-04-19 22:07

【摘要】：研究背景及目的炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)是一组病因尚不明了的慢性肠道炎症,包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)和克罗恩病(Crohn's disease, CD)。 IBD病程迁延,显著影响患者生活质量,又有癌变威胁及发生出血、穿孔、梗阻和瘘管形成等严重并发症的可能性。目前无论药物或手术治疗后,疾病均易复发,尚无根治的方法。因此阐明其病发病机制,为临床诊疗提供新思路及理论支持仍是我们面临的重要任务和挑战之一。目前,随着免疫学、分子生物学等学科的迅速发展,以及动物模型研究的日趋成熟,其病因的探索已经取得了长足的进步,一幅内皮细胞,脑-肠肽/激素,免疫及肠道黏膜内的炎症细胞之间相互作用造成黏膜炎症的图片已经渐渐呈现在我们面前。近年来,多个实验室应用急性或慢性肠炎动物模型研究结果表明,血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide,VIP)、 P物质(substance P,SP)、神经肽Y (neuropeptide Y, NPY)、(?)申经降压素(neurotensin.NT)等与其在肠道黏膜相应受体之间的抗原抗体反应可促进肠道黏膜炎症的发生。尽管脑-肠肽/激素与IBD的关系还需要进一步探讨,目前的研究已提供了有益启示,通过对脑-肠肽/激素研究可加深我们对炎症性肠病的认识,并为其治疗开辟崭新的领域。神经介素U (neuromedin U, NMU)于80年代首次从猪脊髓中发现并分离提纯,因其对大鼠子宫(uterus)平滑肌产生强烈收缩作用,故以U命名。随着对NMU研究的深入,目前发现NMU是一种在胃肠道、中枢神经系统及泌尿生殖系统广泛分布的小分子多肽,不同物种的NMU在长期进化压力下仍具有高度的保守结构,表明NMU具有重要的生理功能。NMU通过与其受体结合发挥作用。NMU的两个特异性的G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors, GPCRs)受体1(neuromedin U receptors1.NMUR1)和受体2(neuromedin U redceptor2,NMUR2)(又名FM3和FM4)广泛分布在动物体内,并具有不同的分布模式,从而使NMU显示出多样性的生理病理功能。NMUR1主要分布在胃肠道及泌尿系统,而NMUR2主要局限在中枢神经系统。现已证实NMU在调节平滑肌收缩、血压与局部血流、肠胃离子转运、能量代谢、摄食行为、胃酸分泌与胃排空、痛觉、癌症等方面具有重要的作用。研究表明,NMU及其受体1均在胃肠道中高表达,其在胃肠道正常的生理功能主要通过激活Gq/11蛋白调节钙内流,诱导肠道平滑肌收缩及蠕动。实验证明,在野生型小鼠及NMUR2敲除小鼠中,NMU诱导的胃肠道平滑肌收缩及蠕动,并未受到影响,另外因NMUR2受体主要在中枢神经系统表达,提示我们NMU/NMUR1轴而非NMU/NMUR2轴在胃肠道的正常生理功能中发挥主要的调节作用。随着对NMU受体的深入研究,发现NMUR1而不是NMUR2分布在肺、脾脏及淋巴细胞等免疫器官及细胞,从而提示NMU/NMUR1轴在免疫调节中也扮演了重要的角色。目前,神经介素U在炎症性疾病中的作用已经在多个疾病模型得到证实,包括皮肤炎症、感染性休克、哮喘及关节炎的NMU缺陷小鼠模型。但是,目前关于NMU参与炎症性疾病的具体机制仍不清楚,国际上尚未见NMU与IBD相关联系的报道。因此,为了进一步探讨IBD的发病机制为将来的治疗提供更多的理论证据与支持,我们课题组将首次探讨了NMU及其受体1-NMUR1在IBD中所扮演的角色。本课题分二部分进行,第一部分：我们首先检测NMU及NMUR1在IBD患者及5%硫酸葡聚糖(Dextran sulfate sodium, DSS)诱导急性小鼠结肠炎模型病变结肠表达情况,初步明确NMU/NMUR1轴是否参与IBD发病；然后经腹腔注射MMU中和抗体干预5%DSS诱导的急性小鼠结肠炎模型,观察实验鼠的临床症状、组织学损伤情况,肠道粘膜与腹腔巨噬细胞中炎症细胞因子表达情况,从而探讨NMU/NMUR1轴在IBD发病中的作用及可能机制。第二部分：构建NMUR1受体高表达的人结肠上皮细胞模型,应用人NMU核心肽干预该细胞,然后应用一系列分子生物学方法,初步探索NMU/NMUR1轴诱导炎症细胞因子IL-8表达、分泌所涉及的信号通路。第一部分神经介素U及其受体1在IBD患者及动物模型的表达及作用机制的初步研究 [目的] 1.检测NMU及NMUR1mRNA在IBD患者及DSS诱导急性结肠炎小鼠模型病变结肠段表达情况。 2.应用NMU中和抗体干预急性小鼠结肠炎模型,研究NMU在肠道炎症中的作用及可能机制。 [方法] 1.定量Real-time PCR检测NMU及NMUR1mRNA在IBD患者及正常对照的结肠组织表达情况。 2.急性结肠炎小鼠模型的建立及标本的采集：FVB小鼠根据实验目的分为两大组：第一大组：FVB小鼠25只,随机分为5组,自由饮用5%DSS溶液8天。分别在第0,3,5,7,8天5个时间点处死小鼠,留取病变结肠段检测NMU及NMUR1mRNA表达情况。第二大组：52只FVB小鼠,随机分为4组,具体分组及干预如下：比较各组小鼠的疾病活动情况(DAI)评分、组织损伤评分、结肠重量／长度以及、髓过氧化物酶(MPO)活性等炎症参数。另外,用Real-time PCR(?)法检测小鼠结肠段及腹腔巨噬细胞炎症细胞因子TNF-α,IL-8,IL-1p,IL-6表达情况。 [结果] 1.NMU及NMUR1mRNA在UC及CD患者及5%DSS诱导急性结肠炎小鼠模型病变结肠段表达水平均显著升高。 2.NMU中和抗体对DSS诱导急性结肠炎症有保护作用。饮用普通水的对照组小鼠体重均有不同程度增加,无小鼠死亡,结肠无明显缩短,MPO几乎测不到。5%DSS造模组体重均有不同程度下降,但IgG组下降程度显著高于anti-NMU组;anti-NMU组小鼠死亡率显著低于IgG组(15%vs0%,P0.05)：anti-NMU组小鼠平均结肠重量与长度的比值显著低于IgG组(0.038g/cm vs0.049g/cm, P0.01); anti-NMU组DAI评分显著低于IgG组；DSS致炎第8天,IgG组小鼠结肠黏膜充血水肿、溃疡形成,腺体不完整或消失,结肠隐窝完全或部分缺失且黏膜固有层炎症细胞浸润明显,而anti-NMU组黏膜水肿少见,无溃疡,腺体排列整齐,仅见少量淋巴细胞和中性粒细胞浸润；组织学损伤评分示,anti-NMU组评分显著低于IgG组(1.2vs3.1,P0.05)；5%DSS造模组小鼠炎症结肠段MPO均有不同程度升高,但anti-NMU组显著低于对照IgG组(60vs115,P0.05)。 3. NMU中和抗体降低急性结肠炎小鼠病变结肠段炎症细胞因子表达水平与IgG组相比,anti-NMU组小鼠病变结肠段1L-8及IL-6mRNA表达显著下(P0.01); TNF-α. IL-1βmRNA表达水平亦显著降低(P0.05)。 4. NMU中和抗体降低急性结肠炎小鼠腹腔巨噬细胞炎症细胞因子表达水平与IgG组相比,anti-NMU组小鼠腹腔巨噬细胞的IL-8及IL-6mRNA表达水平显著降低(P0.01)；TNFa及IL-1βmRNA表达水平亦有下降(P0.05)。 [结论] 1.NMU及NMUR1mRNA在IBD患者及DSS诱导急性小鼠结肠炎模型病变结肠段显著升高。 2.NMU中和抗体对DSS诱导急性结肠炎小鼠模型有保护作用,提示NMU是IBD发病重要的调节介质。其机制可能与促进炎性细胞因子IL-6、IL-8、IL-1β及TNF-α表达分泌有关。第二部分神经介素U通过激活NF-KB及AP-1信号通路调节IL-8表达与分泌 [目的]研究神经介素U的高亲和G蛋白偶联受体1(NMUR1)活化后调节IL-8表达与分泌所涉及的信号通路 [方法] 1.在人正常结肠上皮细胞NCM460基础上构建NMUR1稳定高表达细胞株-NCM460-NMUR1。 2.根据实验目的,应用人NMU核心肽、信号通路药物抑制剂及不同质粒DNA干预NCM460-NMUR1细胞,然后应用：(1) ELISA法检测细胞上清液IL-8浓度。(2)双荧光素酶法检测IL-8启动子活性。(3) Western Blot检测目的蛋白表达。(3)定量Real-time PCR检测细胞c-jun和c-fos mRNA表达水平。(4) ChIP分析：分析p65蛋白与IL-8启动子区κB结合位点结合能力。 [结果] 1. NMU刺激NCM460-NMUR1细胞IL-8转录与分泌成功构建NMUR1受体高表达细胞株NCM460-NMUR1,然后应用NMU干预陔细胞,收集上清检测IL-8浓度。结果示,NMU可显著诱导NCM460-NMUR1细胞分泌IL-8并呈浓度、时间依赖；双荧光素酶结果示,NMU显著增强IL-8启动子活性,增强IL-8基因转录。 2. NMU激活经典NF-κB信号通路 Western blot结果示,NMU刺激NCM460-NMUR1细胞15分钟即可引起细胞总IκBα蛋白降低,p-IκBα蛋白增高,细胞核p65蛋白增加,30-60分钟达到最高水平。ChIP示NMU刺激15分钟后,NCM460-NMUR1细胞核p65蛋白便开始与IL-8启动子区KB位点结合,结合活性逐渐增强,30-60分钟达最高。 3.阻断NF-KB信号通路抑制NMU诱导的IL-8基因转录与分泌 IL-8启动子区KB结合位点变异及IκBα表达质粒可显著降低NMU诱导IL-8转录活性增高；NF-κB信号通路抑制剂咖啡酸苯乙酯(CAPE)显著降低NMU诱导IL-8分泌。 3.NMU诱导核转录因子AP-1亚单位c-un及c-fos表达活化 Real-time PCR(?)吉果示,与对照组相比,NMU刺激NCM460-NMUR1细胞半小时,其c-jun及c-fos mRNA表达水平便显著升高,在1小时达到最高水平后开始下降。Western blot结果与real-time PCR(?)吉果相符,NMU刺激NCM460-NMUR1细胞1小时c-Jun蛋白表达开始升高,2小时c-Jun达最最高水平。 4.AP-1信号通路调节IL-8表达应用IL-8启动子区AP-1结合位点变异、c-Jun siRNA干扰c-Jun表达及A-Fos质粒三种分子生物学方法阻断AP-1通路可显著降低NMU诱导的IL-8转录活性增强,提示AP-1信号通路参与调节IL-8基因转录。 6.NMU激活MAPKs信号通路介导AP-I活化 Western blot结果示,NMU可活化p-ERK1/2, p38及p-JNK蛋白,其中p-JNK与p-p38在NMU刺激30分钟时达高峰,而p-ERK1/2在刺激15分钟时表达便达到最高水平；MAPKs特异性抑制剂PD98059(ERK抑制剂)、SB203580(p38抑制剂)、SP600125(JNK抑制剂)均可显著抑制NMU诱导NCM460-NMUR1细胞c-jun及c-fos mRNA表达,其中SB203580作用更明显。3种抑制剂联合应用有协同效应几乎完全阻断c-jun及c-fos mRNA表达。该研究结果提示MAPK信号通路是AP-1的上游信号分子。 [结论] 在NMUR1高表达的结肠上皮细胞,NMU与NMUR1结合后可激活重要炎症信号通路--经典NF-κB及AP-1信号通路,活化核转录因子NF-κB及AP-1与IL-8启动子区KB及AP-1位点结合调节细胞因子IL-8基因表达、分泌。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R574

【参考文献】