巨噬细胞缺失Cdc42对雨蛙素诱导的急性胰腺炎的影响及其作用机制

发布时间：2020-04-20 12:09

【摘要】：研究目的:急性胰腺炎(AP)是常见的腹部炎性疾病之一,由于胰腺内的胰酶被激活,引起胰腺自身消化、水肿、坏死,可呈自限性。但严重时引起全身性炎症反应和多器官衰竭。细胞分裂周期蛋白42(Cdc42)是Ras超家族,Rho蛋白家族的小GTP酶,与GTP或GDP结合时分别处于激活态、失活态。激活态的Cdc42与不同种类的靶蛋白结合,行使多种调控功能,如细胞骨架重构、细胞粘附、细胞迁移、上皮细胞极化等。本文利用巨噬细胞特异性缺失Cdc42基因的小鼠(Cdc42-Lyz2cre)探讨巨噬细胞中Cdc42基因对急性胰腺炎的影响和作用机制。实验方法:1.选取8-12周龄巨噬细胞特异性敲除Cdc42(F/F+)和不带Cre的Cdc42~(flox/flox)小鼠(F/F-),分成雨蛙素实验组(或实验组)和对照组。2.动物水平:实验组(含F/F+和F/F-小鼠)采用胆囊收缩素类似物━━雨蛙素,用PBS或生理盐水配制原液200 ug/ml(20X),以每小时为间隔,进行8次腹腔注射给药(50ug/5ml/kg)诱导AP;对照组给予PBS或生理盐水,在诱导后的1h、8h、14h三个时间点分别收集全血、血清、胰腺、肺和脾脏。HE染色和免疫组化染色用以观察组织损伤和免疫细胞浸润情况;检测血清中淀粉酶、脂肪酶、单核细胞趋化因子MCP-1(又名CCL2)和炎性因子IL-6、TNF-α的浓度;血常规分析全血中白细胞(WBC)、中性粒细胞(neutrophil)、血小板(thrombocyte)和淋巴细胞(Lymph)的数量变化。3.细胞水平:分别收集对照组和实验组小鼠的腹腔巨噬细胞,RT-q PCR检测炎症因子表达;体外培养F/F+和F/F-小鼠的腹腔巨噬细胞或Raw264.7巨噬细胞,后者给予Cdc42的活性抑制剂ML141,抑制其活性2h后,两者均给予0,10,100,1000ng/ml LPS,分别刺激24h和6h。Western blot检测比较Cdc42对巨噬细胞炎性因子表达的影响。实验结果:1.在实验组中,F/F+小鼠血清中淀粉酶水平更高,且血清中IL-6和TNF-α的浓度也明显高于F/F-小鼠。巨噬细胞特异性敲除Cdc42会显著加重小鼠急性胰腺炎;2.在实验组中,F/F+小鼠的胰腺中CD11b+表达的巨噬细胞浸润数量明显增多,F/F+组肺部中性粒细胞明显增加(AP相关的肺组织损伤),但血清脂肪酶和趋化因子MCP-1水平无差异;3.小鼠血常规结果显示全血中白细胞和淋巴细胞的数量在造模后1h明显减少,中性粒细胞则明显增多,血小板数量表现为增多的情况,随着时间的推移会逐渐恢复正常水平,两组间无明显差异。4.F/F+1h实验组腹腔巨噬细胞IL-6、IL-1β和TNF-α的m RNA表达量显著高于F/F-实验组。5.ML141抑制RAW246.7细胞Cdc42活性后,再给予LPS,CCR2蛋白表达量明显增加,AMPK、NF-κB、ERK的蛋白磷酸化表达明显增加;LPS条件下敲除Cdc42的腹腔巨噬细胞,其CCR2的蛋白表达量也明显增加,AMPK、NF-κB、ERK的蛋白磷酸化表达明显增加。结论:小鼠巨噬细胞Cdc42特异性敲除加重小鼠雨蛙素诱导的急性胰腺炎。本研究显示Cdc42缺失促进了巨噬细胞在炎性因素诱导下对IL-6、TNF-α和IL-1β的转录合成,并通过增加巨噬细胞CCR2的表达,增加急性胰腺炎时胰腺组织中CD11b阳性巨噬细胞的浸润加重胰腺损伤。
【图文】：

制备方法,小鼠,基因型鉴定

Cdc42-Lyzcre小鼠杂交制备方法

骨髓细胞,小鼠,蛋白,腹腔巨噬细胞

图 2.2 Cdc42-LyzCre 小鼠基因型鉴定2.3.2 检测骨髓细胞中 Cdc42 蛋白水平实验室前期在已提取的腹腔巨噬细胞水平验证过小鼠 Cdc42 敲除情况，本实验分离并提取小鼠的骨髓细胞蛋白，采用 Western blot 检测骨髓细胞水平Cdc42 的敲除情况和 Cre 的表达情况，并以内参 β-actin 为对照进行灰度值分析。F/F+组 Cdc42 的蛋白表达量较 F/F-组而言，降低十分明显，，约为 F/F-组的 30%（P<0.05）。F/F+组 Cre 的蛋白条带明亮清晰。表明由骨髓发育而来的巨噬细胞中特异性敲除 Cdc42 小鼠可用。具体见下图 2.3。
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R576

【参考文献】