肝型脂肪酸结合蛋白与非酒精性脂肪肝的关系及药物研究

发布时间：2020-04-24 08:43

【摘要】： 目的：非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)是指与过量饮酒无关的,以肝细胞弥漫性脂肪变性和脂质贮积为主的临床病理综合征。NAFLD的发病率逐年上升,发病年龄逐渐年轻化,已成为全球性的公共卫生问题。然而NAFLD的发病机制尚未明确,临床上仍无有效的治疗手段。目前研究发现,肝型脂肪酸结合蛋白(fatty acid-binding protein, L-FABP)与高甘油三酯血症、高胆固醇血症、肥胖、2-型糖尿病等的形成密切相关。为此,本实验通过高脂饮食建立非酒精性脂肪肝大鼠模型,来观察L-FABP在NAFLD形成过程中的表达,初步探讨L-FABP在NAFLD发病机制中的作用；同时观察降脂益肝冲剂对肝组织中L-FABP mRNA表达的影响,探讨其可能的分子治疗机制,为临床应用提供更加可靠的实验依据。 方法：1.造模与取材雄性清洁级Wistar大鼠80只,重量约为160-220g,适应性喂养1周后,开始正式实验。随机分为8组,每组10只,其中正常组(N1,N2,N3组)以普通饲料喂养,模型组(M1,M2,M3组)和治疗组(D1,D2组)以高脂饲料喂养。每天8：00～9：00am,4：00～5：00pm为喂食和给药的时间。实验动物自由进食和饮水,治疗D1组在给予高脂饮食喂养的同时即给予降脂益肝冲剂16g·Kg-1·d-1(按成年人60kg体质量的剂量(40g／d)计算出大鼠药物剂量),分2次灌胃(ig),共8周；治疗D2组于8周末时给予降脂益肝冲剂,ig(剂量、用法同D1组),共4周。同时模型组和正常组分别给予等量的生活饮用水,ig。在实验第4周末处死正常组(N1组)、模型组(M1组)；在实验第8周末处死正常组(N2组)、模型组(M2组)和治疗组(D1组)大鼠,于12周末处死其余组大鼠。所有大鼠处死前均隔夜禁食并用水合氯醛麻醉,腹主动脉采血,各组大鼠于肝左叶相同部位留取O.1g组织置于1.5mL EP管,-70℃冰箱冻存,用于RT-PCR的检测；另取肝右叶相同部位(1cm×1cm×0.5cm)组织,在4%多聚甲醛中固定,常规制片、HE染色。 2.检测指标：测量各实验鼠的体重、肝脾湿重及体长,并计算肝脾比值、肝指数及Lee's指数等体质指标；将采集的全血用低温离心机迅速分离血浆,丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、血脂(TC,TG)以及肝组织脂质含量在全自动生化分析仪(Olympus Au1000)上测定；采用铜染色法测定血清和肝组织中的FFA水平；采用葡萄糖氧化酶法测定空腹血糖(FBG)；空腹胰岛素(FINS)测定步骤按照放免试剂盒操作步骤进行,并计算胰岛素敏感指数(ISI=ln (1/(FINS×FBG)));在光镜下评估脂肪变性的程度；半定量反转录聚合酶链反应(reverse transcriptase-polymerase chain reaction, RT-PCR)测定L-FABP mRNA的动态表达。 结果：1.正常组(N1,N2,N3组)肝小叶结构完整,肝细胞呈多边形,围绕中央静脉呈放射状,肝窦清晰可见,肝索排列整齐；各项检测指标均在正常范围内,并可观察到L-FABP mRNA的表达。 2.造模4周末(M1组),模型组肝组织呈现轻度脂肪变性；血清转氨酶较正常组有所升高；总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、FFA升高,开始出现脂质代谢紊乱；FBG, FINS开始升高,ISI有所下降,出现轻度胰岛素抵抗；肝组织L-FABP mRNA的表达较其正常组升高。 3.造模8周末(M2组),模型组肝组织呈中度脂肪变性及部分气球样变,形成单纯性脂肪肝,肝脂肪变以大泡性为主；血清转氨酶(ALT, AST)、血脂(TC, TG, FFA)较正常组显著升高；肝组织L-FABP mRNA的表达较其同期正常组显著升高(P0.01)。 4.造模12周末(M3组),模型组肝组织脂肪变加剧并出现肝细胞完全气球样变、小叶内混合有炎症细胞浸润以及散在的点状坏死；与正常组相比,血清转氨酶、总胆固醇、甘油三酯较正常组显著升高；与正常组相比,肝组织L-FABP mRNA的表达显著升高(P0.01)。 5.用药组(D1组),在细胞形态、血脂、转氨酶及肝组织肝型脂肪酸结合蛋白的表达量,与正常组(N1组)比较均无统计学差异,但与4周模型组Ml相比,各项指标均有所改善,具有统计学差异(P0.01)。 6.用药组(D2组),肝组织仍可见索条状排列的肝细胞,脂变程度较同期模型组明显减轻,仅有轻微的炎性细胞浸润,未见明显坏死灶；与M2组相比,ALT, AST, TC, TG明显降低,FBG, FINS亦显著降低,L-FABP mRNA的表达量明显下调(P0.01)。 结论：1.高脂高胆固醇饮食可成功的复制NAFLD大鼠模型；胰岛素抵抗及脂质代谢紊乱与NAFLD的发生关系密切。 2.正常大鼠肝脏可表达L-FABP mRNA, NAFLD模型的大鼠L-FABP mRNA增高,且随造模时间延长表达量明显升高,其增高的程度与NAFLD的程度呈正相关。 3.在NAFLD早期,给予降脂益肝冲剂,可有效的预防NAFLD的发病。 4.降脂益肝冲剂可使ALT, AST, TC, TG, FFA显著降低,说明该药不仅能够逆转肝脏的脂质沉积,而且具有很好的降酶保肝的作用；可使FBG, FINS显著降低,证实该药物可通过有效的改善胰岛素抵抗来达到对NAFLD良好的治疗效果；而L-FABP mRNA的表达明显降低,表明降脂益肝冲剂可以通过调节脂质代谢,减轻肝细胞的脂肪变性,从而达到治疗目的。
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R575.5

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本文编号：2638760