肠道微生物多样性及其与人体代谢相关性的研究

发布时间：2020-04-30 14:32

【摘要】： 人体肠道微生物组是人体最庞大而复杂的微生物群落，也是人体的一个重要的代谢“器官”。在哺乳动物中，肠道微生物在营养物质的摄取、上皮细胞的生长发育、免疫及药物的代谢和毒性方面起重要作用。由于大多数微生物很难或不能用现有技术分离培养，阻碍了人们对其认识。随着分子生态学技术的发展，越来越多的尚未能培养的微生物的基因得到了认识。但是对这些尚未得到纯培养的微生物的分类地位与其功能进行关联，及不同时间、居住环境、饮食和性别等对其的影响还未得到关注。此外，肠道微生物与宿主的相互作用机制及关键功能菌的研究也很缺乏。本研究采用16S rRNA克隆文库技术对中国一家庭的7位健康成员的肠道微生物的多样性进行了全面的认识，共检测7，255条16S rRNA基因全长序列。根据99％的序列相似性，将这些基因序列共划分476个进化型(phylotypes)，其中273个新的进化型；系统发育地位上分属6大菌门：壁厚菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、梭杆菌门(Fusobacteria)，与Eckburg、Gill小组等报道结果基本一致。认识肠道微生物是阐明其与人体健康和疾病关系的第一步。为进一步研究可能影响人体肠道微生物多样性的潜在因素如生活环境、性别和饮食习惯等，本研究运用生物信息学、生态数据分析和多变量数据统计分析等手段，将此家庭的序列数据集与Science杂志已报道的5位美国个体的序列数据集一起，共11，656条16S rRNA全长序列，根据99％的序列相似性，共划分为854个进化型。通过∫-Libshuff分析，结果表明此中国健康家庭成员的肠道菌群组成每个个体间均有显著性差异；与已报道的5位美国个体的肠道菌群结构相比较，发现在门的水平上，结构和组成基本相似；在种的水平上，这两个队列间存在显著的差异；此外，还发现肠道微生物组成结构与性别显著相关。大量研究发现微生物区系的功能通常会随着其组成同时发生变化。Nicholson小组发现中国人群与美国人群代谢表型存在显著性差异，而我们的研究结果发现7位中国个体与5位美国个体的肠道微生物的组成存在显著性差异，因此我们得到这样一个问题：此肠道微生物组成的差异是否与其各自的代谢表型存在关联呢?我们可以根据这一模式深入探索微生物组的组成与代谢表型动态变化，寻找潜在的共变异，鉴定与宿主互作过程中关键的功能菌，揭示宿主与共生微生物潜在的互作机制。因此，对此家庭的肠道微生物整体结构研究之后，我们运用基于PCR-DGGE(变性胶梯度电泳)指纹图谱技术监测家庭成员肠道微生物组的组成结构整体变化；运用基于~1H NMR代谢组学技术监测尿液代谢组谱变化；最后运用基于多变量统计分析方法—正交偏最小二乘法(OPLS)，将此家庭成员的一个月时间间隔的整体代谢变化，同其肠道菌群结构和组成变化进行整体关联分析，研究结果表明此家庭的肠道微生物组成结构与宿主的尿液代谢表型间存在关联；此外，此家庭成员的肠道菌群和代谢都与性别显著相关。通过多变量数据统计分析，我们发现与人体代谢显著相关的潜在的关键功能菌，经过鉴定发现与这些主要的功能菌最近缘的进化型为B. thetaiotaomicron, B. uniformis, B. coprocola, Pseudobutyrivibrio rumints. bacterium mpn-isolate group 25, Rum. bromii, Faecalibacterium prausnitzii 1-88, Subdoligranulum variable BI-114, Bifidobacterium. pseudocatenula等，，主要属于拟杆菌属和梭菌属；尤其Faecalibacterium prausnitzii与8种代谢物质相关；通过对与性别显著相关的条带进行测序分析，发现与其最近缘的进化型为：Eubacterium cligens, Ruminococcus obeum, Klebsiella pneumoniae, Sutterella stercoricanis, Bacteroides thetaiotaomicron, Ruminococcus bromii。同时通过NMR二维谱对关联分析找到的与功能菌相关的代谢物进行签定。其中很多代谢物质为肠道微生物或肠道微生物与宿主共代谢的产物如phenylacetylglutamine(笨乙酰基-谷氨酸盐)，4-cresol sulphate(4-甲酚硫酸盐)，4-hydroxyphenylacetate(4-羟基-乙酸苯酯)。本研究对中国一四代家庭7位成员的肠道菌群进行了全面的认识；运用多变量数据分析，将肠道菌群结构和组成变化与人体尿样代谢谱进行共变异分析；并提出一个新的研究策略从复杂的肠道微生物中寻找关键的功能菌，国内外尚未见类似报道。肠道微生物可以影响人体代谢表型这一现象的发现也为个体化诊疗提供新的研究线索和理论依据。此研究策略也可以应用于探索肠道微生物与宿主的共代谢过程，研究肠道微生物与宿主潜在的相互作用机制及寻找人体健康或疾病的生物标志物。“肠道微生物与人体的代谢的相关性”这一发现也为Gordon小组的最新发现“肠道微生物与肥胖有关”提供了新的佐证。
【图文】：

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图2、中国四代健康家庭16srRNA基因克隆文库组成Flg.2.PereentagesofrelativesequeneesineachPliylumfromeaehfamilymemberandthecombinationofthe7members1.23:2克隆文库序列统计学分析及进化地位分析此中国一健康家庭的7位成员的肠道微生物的多样性进行了全面的研究(见图3a)，共检测了7，255条16SrRNA基因全长序列。根据99%的序列相似性共划分476个OTU，将每个OTU的代表序列与公共数据库中的序列比对，确定其分类地位和种属。将此7位家庭成员的肠道菌群系统发育地位上分属6大门:Fir们nieutes、Baeteroidetes、Proteobaeteria、ACtinobaCteria、、飞rrllcomiCrobia、

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图3.中国一四代家庭7位成员肠道菌群165rRNA基因序列进化树Fig.3.Phylogenetietreebasedonthecombinationofthe7individual165rDNAsequeneedataset.仆etotalnumberofsequenCes，OTUs，andnovelOTIJsofeachcladewereshowninParentheses.Firmicutes门:肠道菌群中数量最多，多样性最复杂的门(G+C含量较低的。+菌门)。包括364个进化型(phylotype)(76.5%)，占整个库克隆数的65.2%。大部分Firmicutes序列属于‘勿‘介记必(99.4%)，0.1%和0.5%分别属于Mouicutes和Bacilli。曰口‘介艺d匆仍然是健康和疾病研究密切关注的研究对象，其与肠道上皮间淋巴细胞的生长的关系，与，J、)L自闭症的相关性等‘。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R574

【引证文献】