Notch信号通路在HBx致L02细胞恶性转化中作用机制的初步研究

发布时间：2020-04-30 23:59

【摘要】：目的本研究旨在研究乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)在致人体非肿瘤系肝细胞L02中的恶性转化作用并初步探讨Notch信号通路在此过程中的作用及机制。方法通过载体将HBx全长基因转入L02细胞构建稳定表达HBx的细胞株L02/HBx,观测转染后细胞的增殖,细胞周期及凋亡的变化。再将其接种细胞于BALB/c裸鼠颈背部皮下,观测其成瘤效应。进一步通过qRT-PCR和Western blotting检测HBx对Notch信号通路重要分子Jagged1, Notch1, Notch1-IC及Hes1表达水平的影响。并应用γ-分泌酶抑制剂DAPT阻断Notch信号通路,通过检测阻断后Notch通路相关效应分子mRNA及蛋白表达水平的变化来判断阻断效率,并观测阻断后细胞的增殖,细胞周期及凋亡的变化。结果 (1)与对照组L02细胞相比,转染HBx后的L02/HBx细胞增殖速度显著加快,凋亡率及G0/G1期细胞比例明显降低,S期细胞比例显著增高。 (2)裸鼠成瘤实验发现,转染HBx后的L02/HBx细胞肿瘤增长速度及肿瘤重量显著高于对照组。 (3)qRT-PCR及Western blotting检测表明, L02/HB x细胞的Notch1, Jagged1, Notch1-IC, Hes1在mRNA及蛋白表达水平上均显著高于L02细胞。*国家自然科学基金(编号: 30971352) (4)应用γ-分泌酶抑制剂DAPT阻断Notch信号通路后,L02/HBx细胞的存活率呈时间-剂量依赖性降低,细胞周期呈时间-剂量依赖性抑制,凋亡呈时间-剂量依赖性增加,而阻断Notch信号通路对正常的L02细胞生物学行为几乎没有影响。结论我们的研究表明,(1)HBx可显著促进人类非肿瘤肝细胞L02细胞株在体外和体内的生长,即HBx可诱导L02细胞发生恶性转化;(2)在这个过程中Notch信号通路的激活是不可缺少的:①在L02细胞中,HBx基因促进Notch信号通路主要分子Jagged-1,Notch-1,Notch1-IC,Hes-1在mRNA及蛋白水平上的表达,即在L02细胞中,异位表达的HBx可激活Notch信号通路。结合第一部分的研究结果,初步表明Notch信号通路的激活与HBx刺激L02细胞的增殖并促进其转化有关;②通过γ-secretase抑制剂DAPT阻断L02/HBx细胞的Notch信号通路后,HBx所介导的L02细胞恶性转化的生物学效应亦被阻断,且呈剂量-时间依赖性;③而DAPT阻断正常L02细胞的Notch信号通路对其生物学效应几乎没有影响。推测Notch信号通路在HBx致L02细胞恶性转化中起关键作用。
【图文】：

示意图,抑制剂,信号通路,示意图

关系更少有研究。鉴于此，本研究旨在观测 HBx 在肝细胞 L02 中的恶性转化作用并初步探讨 Notch 信号通路在此过程中的作用及其机制。本研究中，我们首先通过测稳定转染 HBx 基因的 L02 细胞相对于正常 L02 细胞的细胞增殖，细胞周期，凋及裸鼠成瘤的变化，，研究 HBx 对 L02 细胞生物学行为的影响；然后应用 qRT-PCRWestern blotting 的方法检测转染细胞及未转染细胞中 Notch 信号通路的表达；最后用 γ-secretase 抑制剂（该抑制剂通过抑制 γ-secretase 的活性从而抑制 Notch 的活性段 NICD 的生成，达到抑制 Notch 信号通路的目的，见图 1）来阻断转染细胞及未转细胞的 Notch 信号通路，通过研究细胞生物学行为如细胞增殖，细胞周期及凋亡的化，来探讨 HBx 和 Notch 信号通路在 L02 细胞恶性转化中的作用及相互关系。

重复测量数据,烤箱,下连续,培养细胞

烤箱，68 度，30min；树脂封片。分析SPSS17.0 软件进行统计学分析，数据以 mean±SD 表多个样本间的比较采用方差分析或重复测量数据的方。 L02 细胞增殖的影响件下连续培养细胞 24~96h，CCK-8 法检测各组细胞果显示 L02/HBx 组细胞增值速度快于对照组 L02/pc 开始出现出现显著差异（p＜0.05），72h、96h 差异3.1 组和 L02 组间无统计学差异(图 1)。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R512.62

【参考文献】