携带hIL-10基因的双歧杆菌治疗小鼠溃疡性结肠炎的研究

发布时间：2020-05-01 20:49

【摘要】：目的：溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)属于炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD),其发病机制仍未完全阐明。细胞因子白细胞介素-10(cytokine interleukin-10,IL-10)作为一种负性炎症调控的细胞因子,可以下调UC肠道的炎症级联放大反应,是UC的一种有效的干预治疗措施。然而,商业合成的重组人白细胞介素-10(human interleukin-10,hIL-10)有合成工艺复杂、价格昂贵、用药途径不方便等缺点,大大限制临床应用。双歧杆菌可以改善UC患者的肠道菌群,其治疗UC效果明确、价格低廉,已广泛应用于临床。因此,本实验用以往已构建好的、并验证过能在双歧杆菌内稳定、高效、分泌性表达的大肠杆菌-双歧杆菌穿梭质粒载体(pBBAD-Xs),将hIL-10基因克隆入该表达载体,筛选并鉴定携带hIL-10的分泌型转基因双歧杆菌(transforming a hIL-10-containing plasmid into B. Longum,BL-hIL-10),通过体内和体外试验,验证所分泌的hlL-10蛋白是否具有生物学活性和治疗功能,由此进一步探索BL-hIL-10冶疗溃疡性结肠炎的相关机制。方法：(1)选择以往试验已构建好的质粒载体pBADs-GFP与生物合成的含有hIL-10质粒,通过双酶切、酶连反应构建并鉴定pBADs-hIL-10穿梭质粒,将pBADs/hIL-10质粒电转化入长双歧杆菌(NCC 2705),合成BL-hIL-10,筛选出阳性克隆菌株,用RT-PCR法验证质粒hIL-10的基因表达后,以0.2%L-阿拉伯糖(L-arabinose,L-Arb)诱导表达12h、24h、48h后,分别用ELISA和Western blot法验证转基因双歧杆菌中hIL-10蛋白表达水平,并选择最佳的诱导表达时间。(2)在悬浮培养的THP-1中加入含有hIL-10蛋白的菌液培养上清,用CCK法检测细胞毒性试验。(3)hIL-10蛋白的体外生物学活性试验：将菌液培养上清与1μg/mL脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)共同培养THP-1 8h后,用ELISA法测定培养液中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-a)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的变化情况。(4)hIL-10蛋白的体内治疗功能性试验：用5%葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium,DSS)诱导UC小鼠模型后,给予UC小鼠模型口服0.2%L-Arb诱导表达后的BL-hIL-10连续治疗7天。①UC小鼠模型全身和肠道炎症反应情况评估：检测UC小鼠模型疾病活动指数(disease activity index,DAI)／C结肠长度测定、病理组织学评分,化学比色法检测髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)的活性;②NF-KB信号转导通路评定：ELISA去检测小鼠外周血TNF-α、IL-6表达水平；分别用改良的ELISA法和Western blot法测定肠道NF-KB(p65)DNA结合活性及蛋白表达水平；分别用qRT-PCR法(?)口ELISA法测定肠道组织内TNF-α、IL-6、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)的mRNA基因表达水平与蛋白水平；③UC小鼠模型CD4~+CD25~+Foxp~(3+)调节T细胞(CD4~+CD25~+Foxp~(3+) Treg)的表达测定：用流式细胞术测定小鼠外周血和肠系膜淋巴结内CD4~+CD25~+Foxp~(3+)Treg与CD4~+CD25~+细胞的百分数。结果：(1)在长双歧杆菌NCC 2705中,成功的构建了能分泌hIL-10蛋白的(?)BL-hIL-10传递体：其最佳诱导的表达时间是24h。(2)含有hlL-10的转基因双歧杆菌培养上清对悬浮培养的THP-1细胞无细胞毒性。(3)培养上清能抑制LPS刺激的THP-1所分泌的TNF-α、IL-6的表达水平。(4)BL-hIL-10、B.Longum(BL)和转pBADs-0双歧杆菌(transforming a pBADs-0 plasmid into B.Longum,BL0)通过降低小鼠DAI、改善病理组织炎症表现、抑制MPO活性;BL-hIL-10可以抑制UC小鼠肠道内被激活的NF-κB信号转导通路；BL-hIL-10可以上调UC小鼠外周血及肠系膜淋巴结的CD4~+CD25~+Foxp~(3+) Treg的表达水平。(5)BL-hIL-1治疗组的治疗效果明显优于BL和BZO治疗组。结论：在长双歧杆菌(NCC 2705)内成功构建了一种新的、有效的IL-10的传递系统,通过体内、体外试验,证实了BL-hIL-10所分泌的hlL-10蛋白具有IL-10细胞因子的生物学活性和治疗功能性。通过对相关机制的探索发现,BL-hIL-1O抑制了UC小鼠模型肠道内被激活的NF-κB信号转导通路和上调外周血及肠系膜淋巴结的CD4~+CD25~+Foxp~(3+)Treg的表达水平,在一定程度上,控制了UC小鼠模型全身及肠道的炎症反应。因此,BL-hIL-10具备了双歧杆菌和IL-10双重优势,且无明显毒副作用、生产工艺简单、治疗方法简便、治疗效果显著。BL-hIL-10有望成为拥有IL-10治疗作用的,并能够调节UC肠道微生态的新一代益生菌。
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R574.62

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