miR-340通过靶定SPP1抑制肝星状细胞活化

发布时间：2020-05-04 06:56

【摘要】：目的探讨miR-340对肝星状细胞活化、增殖和TGF-β1/Smads信号通路的影响,确定miR-340通过靶定SPP1调控TGF-β1/Smads信号通路抑制肝星状细胞活化和增殖。方法1将20只雄性SD大鼠随机分为对照组、模型组,胆总管结扎手术制备胆汁淤积性肝纤维化动物模型。2 Agilent mRNA表达谱芯片数据结果分析,选取具有显著差异的SPP1作为研究对象。3通过计算机生物信息学网站miRanda和Starbase预测并筛选出miR-340与SPP1之间存在高度保守的互补序列。4 5ng/ml TGF-β1处理LX-2细胞,q RT-PCR检测miR-340和SPP1基因mRNA表达水平的变化。5实时荧光定量PCR和Western blot检测组织中SPP1 mRNA和蛋白的表达水平。6构建miR-340过表达载体pc DNA3/pri-miR-340,将重组质粒转染人肝星状细胞系LX-2细胞,实验分为转染pc DNA3/pri-miR-340质粒组(miR-340组)及转染其对照pc DNA3空载质粒组(pc DNA3组)、miR-340 inhibitor组和对照NC inhibitor组四组。7使用双荧光报告载体实验验证miR-340对靶基因的直接调控作用。8实时荧光定量PCR和Western blot检测过表达miR-340或者miR-340功能被抑制后,肝星状细胞LX-2中miR-340、SPP1、α-SMA和collagen I mRNA和蛋白以及p-Smad2、p-Smad3蛋白的表达水平。9 CCK-8实验检测miR-340对LX-2细胞增殖能力的影响。10构建pc DNA3/SPP1、sh R-SPP1质粒,q RT-PCR和Western blot实验从mRNA和蛋白水平验证过表达或者沉默SPP1对LX-2细胞中SPP1、p-Smad2、p-Smad3、SPP1、α-SMA和collagen I相对表达水平的影响。11CCK-8实验检测SPP1对LX-2细胞的增殖能力的影响。结果1模型组的ALT、AST、TBIL和TBA指标均高于对照组,胆汁淤积导致大鼠肝纤维化。2与对照组相比,胆汁淤积性肝纤维化模型组肝组织中的SPP1表达升高。3 LX-2细胞经过TGF-β1处理后的miR-340 mRNA表达降低而SPP1 mRNA和蛋白的表达升高。4双荧光报告载体实验证明了miR-340对SPP1的直接调控作用。5与pc DNA3对照组相比,miR-340在肝星状细胞LX-2中过表达后,miR-340组细胞中miR-340 mRNA表达水平升高,而SPP1、α-SMA和collagen I mRNA和蛋白的表达均降低,p-Smad2、p-Smad3蛋白的表达也降低;封闭细胞内源性的miR-340功能后,引起相反的结果。6 CCK-8实验结果显示,过表达miR-340抑制LX-2细胞的增殖。7与对照组相比,pc DNA3/SPP1组、p-Smad2、p-Smad3、SPP1、α-SMA和collagen I蛋白的表达均升高;干扰SPP1后,引起相反的结果;8 CCK-8实验结果显示,SPP1促进LX-2细胞的增殖。结论1 miR-340抑制LX-2细胞活化,细胞外基质沉积和增殖,抑制TGF-β1/Smad信号通路的激活。2 SPP1是miR-340的直接靶基因,miR-340可以负性调节LX-2细胞中SPP1基因。3 SPP1基因可促进LX-2细胞活化、细胞外基质沉积和增殖,促进TGF-β1/Smad信号通路激活。4 miR-340可能通过靶定SPP1来调节TGF-β1/Smad信号通路从而抑制肝星状细胞活化,从而影响肝纤维化发生和发展的过程。图19幅;表1个;参115篇。
【图文】：

而且被结扎的胆总管处突出，如图 1B。注：A-对照组；B-模型组图1 大鼠肝脏组织标本Fig.1 Rat livers1.3.2 胆汁淤积性肝纤维化大鼠血清生化指标实验分为对照组、模型组。生化指标结果模型组的 ALT、AST、TBIL 和TBA。实验结果显示，大鼠胆汁淤积肝纤维化模型组生化四项指标均高于对照组组。大鼠胆汁淤积肝纤维化模型制造成功。表 1 各组大鼠血生化指标（n = 3, x ±s）Table 1 The blood biochemical indexes of rats in each group（n=3, x ±s）分组 对照组 模型组ALT μmol/L44.5±1.9 102±2.16AST μ/L132.5±12.9 443.9±22.0TBIL μ/L10.5±0.43 149.5±10.7TBA μmol/L2.57±15.6 217±11.93

注：A-聚类分析热图；B-GO 功能分析；C-Pathway 分析图2 大鼠胆汁淤积性肝纤维化模型mRNA差异表达芯片分析Fig.2 Analysis of mRNA differentially expressed microarray in rat model of cholestatic hepatic fibrosis1.3.4 与 SPP1 基因具有靶定关系 miRNA 的筛选生物信息学网站 Starbase、miRanda 的预测结果筛选出 SPP1 为 miR-340 的候选靶基因，，如图 3。图3 生物学预测SPP1与miR-340靶定关系Fig.3 Relationship between biological prediction of SPP1 and miR-340 targeting1.3.5 肝脏组织中 SPP1 mRNA 相对表达水平
【学位授予单位】：华北理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R575.2

【参考文献】

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本文编号：2648275