Perilipin 5通过调控AMPK信号通路诱导活化肝星状细胞凋亡的机制

发布时间：2020-05-05 18:20

【摘要】：背景和目的活化的肝星状细胞(HSCs)是肝纤维发生过程中的关键细胞。诱导活化的HSCs细胞凋亡有助于逆转肝纤维化。静止期的HSCs细胞质中含有丰富的脂滴。Plin 5是脂滴表面的包被蛋白,在维持哺乳动物细胞的脂质稳态中起着关键作用。然而,目前对HSCs激活状态下Plin 5的作用机制知之甚少。在本报告中,体外培养大鼠原代HSCs(rHSC-primary),探索Plin 5在肝纤维化中的作用和机制。采用293T细胞包装慢病毒系统,产生病毒颗粒(pFLRu-PLIN 5),将其转导到培养的大鼠原代HSCs中用于实验。探讨Plin5对活化的HSCs增殖的影响以及AMPK是否参与Plin 5调控细胞凋亡、自噬和线粒体功能障碍,为Plin 5诱导活化的HSCs细胞凋亡提供了新机制,为治疗肝纤维化提供新的靶点。方法(1)分别从健康大鼠、C57BL/6J小鼠和NAFLD模型C57BL/6J小鼠中分离肝脏组织、内脏脂肪和原代HSCs;体外培养细胞系大鼠HSC-T6和小鼠HSC-GRX;RT-PCR和免疫荧光实验检测各组织、细胞中Plin 5、Plin 1、Plin 2、Plin 3和HIG 2水平。(2)体外培养转导pFLRu-PLIN5的rHSC-primary。荧光显微镜和MTS法观察其增殖状态;Western blot测定α-SMA和胶原蛋白、测定Cyclin D1和p21水平。(4)用或不用ICE-蛋白酶抑制剂处理Plin 5过表达的rHSC-primary,Western blot检测Bcl-2和Bax、caspase级联酶水平和caspase-3活性。(5)使用不同浓度AICAR处理rHSC-primary 24小时。Western blot检测AMPK的磷酸化、各组自噬相关基因ULK1和LC3的磷酸化水平。(6)分别用化合物C和氯喹预处理转导pFLRu-PLIN5的rHSC-primary。MTS测定增殖细胞情况;Western blot评估caspase-3活性、AMPK的磷酸化、Bcl-2和Bax、Cyclin D1和p21水平。(7)pEGFP-LC3与pFLRu-PLIN5共转导于rHSC-primary。在荧光显微镜下观察LC3荧光斑点的百分比。(8)用或不用丙酮酸甲酯、ICE-样蛋白酶抑制剂预处理pFLRu-PLIN5转导的rHSC-primary。RT-PCR检测PGC-1α水平;ATP测定试剂盒测定ATP水平;Western blot分析Caspase-3活性、AMPK水平、Bcl-2和Bax、Cyclin D1和p21水平。结果(1)Plin 5 mRNA水平在内脏脂肪、静息期HSCs、健康肝脏、D7-HSCs依次呈下降趋势(P0.05)。与静息状态HSCs相比,活化HSCs中Plin 2水平下降超过50%(P0.05)。而Plin 1、Plin 3和HIG 2的mRNA水平在HSCs的两种状态下无明显差异(P0.05)。与正常饮食组小鼠相比,高脂饮食喂养组的小鼠HSCs的Plin5和Plin2分别下降90%和40%(P0.05)。(2)镜下和MTS法观察发现Plin 5过表达的rHSC-primary活性降低、α-SMA和胶原蛋白的产生减少、Cyclin D1蛋白表达下降,p21蛋白表达升高(P0.05),细胞增殖受到抑制。(3)rHSC-primary中Plin 5过表达,下调Bcl-2,上调Bax,增加PARP、caspase-3和caspase-9水平(P0.05),其变化可被caspase蛋白酶抑制剂逆转(P0.05)。(4)Plin 5过表达的rHSC-primary和经过AICAR处理的rHSC-primary,AMPK磷酸化水平增加,AICAR剂量依赖性地增加LC3-II/LC3-I的比率(P0.05)。(5)化合物C预处理转导pFLRu-PLIN5的rHSC-primary时发现,化合物C消除了Plin5过表达诱导的HSCs细胞周期停滞和细胞凋亡作用(P0.05)。(6)rHSC-primary转导pFLRu-PLIN5慢病毒后,p-AMPK、p-ULK1和LC3-II/LC3-I水平明显增加(P0.05)。这些作用结果均可以被氯喹消除(P0.05)。(7)pFLRu-PLIN5转导的rHSC-primary经过pEGFP-LC3转导后,LC3亮斑增加(P0.05)。(8)Plin 5过表达的rHSC-primary,p-AMPK、p21水平均增加,线粒体功能的调节因子PGC-1αmRNA、ATP、Cyclin D1与Bcl-2水平下降(P0.05)。而这些作用可以在补充ATP水平后恢复(P0.05)。结论Plin 5损伤线粒体的生物合成,降低ATP水平,激活AMPK信号通路,诱导HSCs的凋亡。
【图文】：

15图 1 Plin 5 表达水平随 HSCs 的激活显著降低real-time PCR 检测来自大鼠(左，实体)和小鼠(右，空心)的不同组织或 HSCs 群中 Plin mRNA 水平。#与脂肪组织比较, P<0.05，§与静止 HSCs 比较，，P<0.05,n=6。 real-time PCR 显示培养 1 天和 7 天 HSCs 的 Plin 5 mRNA 水平。#与培养 1 天 HSCs 比, P<0.05，n=6。C.荧光免疫染色显示培养 1 天和 7 天大鼠 HSCs 的 Plin 5 蛋白含量变化。

17图 2 外源性 Plin 5抑制活化原代大鼠HSCs增殖A.Western blot (上图) 和 real-time PCR(下图)显示原代大鼠 HSCS 慢病毒转导效率。β-actin 为等量上样对照。B.MTS 检测原代大鼠 HSCs转导 pFLRu-PLIN5后的增殖情况。数据以(x±s)表示对照组百分比。#与未处理细胞比较, P<0.05，n=3。C.Western blot 分析原代大鼠 HSCs 转导 pFLRu-PLIN5 后纤维化生物标志物。# 与未处理细胞比较，P<0.05，n=3。D.Western blot 分析转导 pFLRu-PLIN5 原代大鼠 HSCs 的 Cyclin D1 和 p21 等细胞周期相关蛋白。#与未处理细胞比较，P<0.05，n=3。β-actin 为等量上样对照。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R575.2

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本文编号：2650565