主要穹窿蛋白（MVP）与乙型肝炎病毒（HBV）感染的相关性研究

发布时间：2020-05-08 22:01

【摘要】：乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)是引起肝硬化和肝细胞癌(hepatocellular carcinoma)的一个主要因素,乙型肝炎病毒感染是一个全球性的健康问题。有研究人员比较HepG2和HepG2.2.15两个肝癌细胞系的基因表达谱后发现,在HBV整合的HepG2.2.15细胞系中,有数个基因的表达量比HepG2细胞要高。这些基因包括了一些干扰素诱导的基因,其中包括可以被干扰素γ诱导的基因MVP。MVP基因编码主要穹窿蛋白(major vault protein),它是构成穹窿体(vault)的主要成分。既然MVP的表达可以被HBV上调,说明MVP也许参与到病毒与宿主细胞的相互作用中。目前还没有文献报道MVP与乙型肝炎病毒感染之间的联系。 为了研究探讨MVP与HBV感染之间的相互关系,我们首先检测了健康人与乙肝病人血清中MVP的水平差异。经过ELISA检测,我们发现乙型肝炎病人血清中MVP的含量(109.19±55.14ng/ml)较之健康人血清中的含量(62.48±22.94ng/ml)明显要高。为探讨HBV上调MVP的机制,我们通过PCR获得了MVP基因的启动子,将其构建到含luciferase报告基因的质粒pGL3-basic,通过报告基因检测系统,我们发现HBV能上调MVP启动子的活性,进一步采用Western Blot检测了HBV对MVP的调节,结果显示,HBV在蛋白水平上上调MVP的水平。 为了研究HBV感染与MVP之间的关系,我们将MVP的编码区构建到了真核表达载体pCMV-Tag2B中,采用HBV的感染性克隆pHBV1.3感染细胞以产生HBV病毒,通过用ELISA法检测被感染细胞上清中HBsAg和HBeAg水平,并用荧光定量PCR法检测感染细胞中HBV复制中间体DNA水平,并用Northern Blot检测了RNA水平,结果发现MVP蛋白在细胞水平能够促进HBV的表达和复制。此外,我们构建了针对MVP的shRNA,发现当MVP的表达被干扰之后,HBV的复制水平被抑制,从另一方面也证明了MVP对HBV的复制起到促进作用。 接着我们想探讨MVP调控HBV的复制的分子机制。于是将MVP与HBV全长启动子转染到HepG2细胞中,发现MVP可以上调HBV全长启动子的活性。在HBV全长启动子上有一些转录因子作用位点,包括Stat3,HNF-1,Sp1,C/EBP等。文献报道Stat3参与人类多种肿瘤的发生及发展进程,因此我们希望研究一下在MVP对HBV的调控中,Stat3是否也参与其中。通过干扰RNA实验,我们发现当将HepG2细胞中的Stat3干扰掉后,MVP对HBV全长启动子的上调作用被削弱,说明Stat3在MVP对HBV全长启动子的调控过程中有一定的作用。接着我们就通过ChIP实验证实MVP可以增强Stat3与HBV全长启动子上对应结合位点的结合。最后我们用Western Blot实验证实,过表达MVP可以上调细胞中Stat3的表达,并且MVP可以促进Stat3从细胞质到细胞核的转移。这都说明,在MVP对HBV全长启动子的调控过程中,Stat3起到了非常重要的作用。 干扰素a是用于治疗乙型肝炎病毒感染的常用药物,由于文献报道MVP与细胞的耐药性相关,我们研究了MVP对于干扰素对病毒的抑制作用的影响,首先我们检测了在MVP存在的情况下,干扰素α对乙肝病毒S和E蛋白的抑制情况,发现过表达MVP时,干扰素a对乙肝病毒S蛋白和E蛋白的合成的抑制作用减弱。接着我们用荧光定量PCR技术检测了干扰素下游的几个抗病毒基因PKR,2'-5'OAS,MxA的表达情况,发现MVP在一定程度上对这几个基因有抑制作用。所以推测MVP在干扰素抗病毒过程中有着一定负调控作用。 由于MVP在各种癌细胞中的表达量普遍较高,而且文献报道MVP与细胞耐药性相关,我们认为本研究为HBV的致病机理提供了新的证据,同时为HBV的基因治疗奠定了一定的理论基础。
【图文】：

慢性HBV感染的不同阶段(SurakitP,2007)

电镜冷冻烛刻技术得到的穹Xu体结构图
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R512.62

【共引文献】

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本文编号：2655111