内质网应激在酪氨酸代谢障碍诱导肝纤维化中的作用和机制研究

发布时间：2020-05-13 06:59

【摘要】：研究背景和目的肝纤维化(Hepatic fibrosis,HF)是多种慢性肝病的共同病理过程,晚期肝纤维化可导致肝硬化、肝功能衰竭、门静脉高压甚至肝癌。肝纤维化是由于肝脏受到多种内外界因素刺激或持续性肝脏损伤,引发肝内炎症反应和修复机制,损伤的肝细胞可以激活肝星状细胞,使其转变为肌成纤维细胞,肌成纤维细胞通过分泌纤维原性因子促进肝细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)沉积形成。肝纤维化是一个动态过程,表现为ECM合成大于降解。当肝纤维化逐渐加重时,正常的肝小叶结构遭到破坏和改建,沉积的纤维包围成假小叶,即形成不可逆转的肝硬化。当前肝纤维化发生和逆转的调控机制仍不明确,若能发现和阐明肝纤维化形成的调控机制,可为肝纤维化的预防和治疗提供新的手段,为肝纤维化药物研发提供新的策略和方法。近年来,内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)在肝脏疾病发展过程中的作用越来越受到人们的关注。肝细胞在应对外界刺激时,蛋白质的合成和分泌明显增加。同时,各种损伤因素作用于内质网,将共同加重内质网负荷,导致未折叠的蛋白在内质网内堆积,刺激内质网膜上感受蛋白,从而导致内质网应激。内质网应激是细胞的一种自我调节机制,可导致未折叠蛋白反应(Unfolded protein response,UPR),UPR可以激活相关启动子mRNA产生,通过降低全细胞蛋白质合成,表达特定分子伴侣,促进蛋白质正确折叠等途径,减轻内质网负荷,最终达到缓解内质网压力的目的。UPR会导致多种效应,包括适应缓解、炎症反应、自噬和凋亡,而内质网应激激活后具体通过何种途径引起肝纤维化目前还不清楚。FAH(fumarylacetoacetate hydrolase,FAH)基因剔除大鼠(简称Fah~(-/-)大鼠)因为酪氨酸代谢障碍产生肝纤维化表型。人Fah基因的缺失将导致I型遗传性高酪氨酸血症(hereditary tyrosinemia type 1,HT1)。本研究通过应用酪氨酸代谢障碍诱导的肝纤维化大鼠模型(Fah~(-/-)大鼠),讨论酪氨酸代谢障碍引起的肝细胞损伤导致内质网应激及随后的肝细胞凋亡在肝纤维化发生中扮演的角色。研究发现,内质网应激在酪氨酸代谢障碍导致的肝纤维化中显著激活,且应激无法得到恢复。同时,其促凋亡信号通路激活,引发肝细胞凋亡。通过给予药物缓解内质网压力,则可以使内质网应激走向恢复而不引发细胞凋亡反应,从而减轻和治愈肝纤维化。进一步的,我们的研究还发现,与Fah~(-/-)大鼠相反,相同病因的Fah~(-/-)小鼠肝损伤后并不发生肝纤维化,检测发现Fah~(-/-)小鼠肝细胞发生了内质网应激,但其致凋亡信号通路没有激活,肝细胞损伤后不发生凋亡,最终不形成肝纤维化。通过研究内质网应激及其引发的凋亡作为肝损伤与肝纤维化之间的纽带作用,本研究提出可将内质网应激作为肝纤维化新的治疗靶点。本研究将加深对肝纤维化发生机制的认识,为临床诊断治疗肝纤维化和药物研发提供新策略。研究方法1.饲养繁殖和鉴定Fah~(-/-)大鼠,在饮水中停止添加NTBC药物从而诱导肝损伤,建立Fah~(-/-)大鼠肝损伤后诱导肝纤维化的病理模型并开展相关分析。2.以撤除NTBC的Fah~(-/-)大鼠作为对照组,撤除NTBC同时给予内质网应激缓解药物苯基丁酸(4-PBA)的Fah~(-/-)大鼠作为实验组,观察缓解内质网应激是否对实验组大鼠肝纤维化具有抑制作用。3.观察相同基因缺陷的Fah~(-/-)小鼠肝损伤后的肝纤维化表型并开展相关分析。4.应用I型遗传性酪氨酸血症患者的肝脏标本,观察内质网应激在HT1患者中的激活情况。研究结果1.Fah~(-/-)大鼠停止NTBC给药后,毒性代谢产物增加持续诱导肝细胞损伤,肝脏形成明显的纤维化表型。2.损伤的Fah~(-/-)大鼠肝细胞发生内质网应激,内质网相关凋亡通路激活,肝细胞发生凋亡。3.与肝损伤前Fah~(-/-)大鼠相比,损伤后的肝脏发生内质网应激,内质网相关凋亡通路激活,肝细胞发生凋亡。4.Fah~(-/-)小鼠肝损伤后不发生肝纤维化,肝细胞内质网应激水平上调,但没有发生细胞凋亡。5.I型酪氨酸血症患者肝脏标本中可检测到内质网应激相关凋亡通路蛋白激活,肝细胞发生凋亡,和Fah~(-/-)大鼠具有相似的表型。6.患有I型酪氨酸血症的人肝脏可检测到肝细胞凋亡,与正常人类肝脏相比,CHOP和TUNEL染色细胞阳性率显著增加。结论1.模拟人I型酪氨酸代谢障碍的Fah~(-/-)大鼠模型发生肝损伤后,出现了与人类疾病类似的肝纤维化病理表型,出现AST、ALT升高,肝星状细胞激活,炎症因子分泌,免疫细胞的招募和活化等。2.损伤的Fah~(-/-)大鼠肝细胞发生内质网应激,持续的内质网应激激活了内质网相关凋亡通路,凋亡相关因子CHOP的表达促进肝细胞的凋亡,肝脏内凋亡细胞增多,不断产生的凋亡小体引发炎症反应激活肝星状细胞,促使纤维原性因子分泌,导致肝内纤维沉积进而发生肝纤维化。3.Fah~(-/-)小鼠肝损伤后发生内质网应激,但强度不足以导致内质网相关凋亡通路激活,从而不发生肝纤维化。4.利用内质网应激缓解药物治疗Fah~(-/-)大鼠肝损伤,用过抑制PERK/IRE1-CHOP通路,减轻内质网应激导致的凋亡,可以缓解肝脏炎症反应和免疫反应,减少肝星状细胞激活,从而显著抑制Fah~(-/-)大鼠肝损伤后肝纤维化的程度。5.HT1患者肝脏标本中可观察到内质网相关的细胞凋亡。综上,内质网应激在酪氨酸代谢性肝损伤导致的肝纤维化中发挥了重要作用,内质网应激相关的细胞凋亡是其致肝纤维化的机制之一,内质网应激可以作为临床治疗肝纤维化潜在的用药靶点。
【图文】：

实验结果一、Fah-/-大鼠基因型的鉴定课题所采用的 SD 品系 Fah-/-大鼠为中科院惠利健实验室建立，改大鼠模型采用CRISPR/Cas9 系统建立。利用设计的 sgRNA，引发 Fah 基因第二外显子突变，导致移码突变或者翻译提前终止（图 1A）。实验所用大鼠出生后四周采用剪鼠尾提取DNA 的方法，通过设计的 PCR 引物，进行 Fah 基因扩增，对大鼠基因型进行鉴定（图 1B）。Fah-/-大鼠饮用水中加入药物 NTBC 治疗酪氨酸代谢异常，饲养 6 月余，其体态毛发、活动程度与正常大鼠无异。体重增长曲线与野生型大鼠对比无明显差异（图 1C）。对于饮用水中给予 NTBC 药物饲养的 Fah-/-大鼠进行肝功能检测，其各项指标与野生型大鼠无明显差异（图 2）。结果表明，大鼠的 Fah 基因为突变型基因纯合子，其肝细胞无法表达正常 FAH 蛋白，而给予 NTBC 药物饮水的 Fah-/-大鼠，其表型、生长状况及肝功能与野生型大鼠没有显著差别。

内质网应激在酪氨酸代谢障碍诱导肝纤维化中的作用和机制研究程度加剧，，Fah-/-大鼠肝脏颜色逐渐变为暗黄色，表面粗糙，呈颗粒状，边缘变钝，质地变硬。在损伤 30 天时，肝脏部分表面已经出现了明显的坏死和出血区域，肝脏表面可见明显的小结节，这是肝纤维化向肝硬化发展的表现（图 3C）。对停药Fah-/-大鼠行眼底静脉丛取血术，全血放置凝血后取上层血清进行肝功能各项指标检测，结果表明发生酪氨酸代谢障碍的 Fah-/-大鼠各项肝功能指标均随肝损伤时间进展而发生异常：谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）水平显著提高，血清白蛋白（ALB）显著下降，说明酪氨酸代谢障碍积累的毒性代谢产物给 Fah-/-大鼠肝细胞造成了严重损伤，血内总胆红素（TBIL）升高提示 Fah-/-大鼠肝损伤后出现胆汁排出受阻（图 4）。
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R575.2

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