YAP在肝纤维化及其逆转中功能和调控机制的研究

发布时间：2020-05-16 03:30

【摘要】：Yes相关蛋白(YAP)是Hippo信号通路中重要的下游蛋白,在细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移等方面具有重要作用,YAP还在各种肝脏疾病的进展中发挥作用。然而,YAP在肝纤维化的发生发展和逆转中的功能及机制尚未被研究。在肝纤维化的进展过程中,活化的肝星状细胞增殖增加,凋亡减少,并且肝星状细胞的凋亡是肝纤维化逆转的一个关键途径,因此我们猜想YAP是否能够对活化的肝星状细胞增殖和凋亡产生作用。现研究表明,在肝纤维化发生发展中,Wnt/β-catenin信号通路被激活,使得肝星状细胞(HSCs)活化和增殖,同时YAP与Wnt/β-catenin信号通路有着密切的联系,因此我们也探究了YAP是否能够通过Wnt/β-catenin信号通路调节HSCs活化和增殖。为了研究YAP在肝纤维化进展和逆转的过程中的作用,我们向小鼠腹腔注射10%四氯化碳(CCl_4),每周2次,注射4周,建立小鼠肝纤维化模型,逆转组的小鼠注射4周的10%CCl_4后停止注射,自然恢复6周,建立小鼠肝纤维化逆转模型。我们通过谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)的变化以及病理学检测如HE,Masson和天狼猩红染色证明模型的建立成功,并且提取小鼠肝脏组织的蛋白,原代肝星状细胞的RNA,通过Western Blot和实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测YAP的变化,发现YAP在肝纤维化小鼠中表达上升,而在逆转组小鼠中表达降低。同时提取了转化生长因子β1(TGF-β1)刺激的HSC-T6细胞以及接着用脂肪细胞诱导分化剂(MDI)逆转细胞的蛋白,通过Western Blot和RT-PCR检测了YAP的变化,发现YAP在TGF-β1刺激的细胞中表达升高,而在MDI逆转后表达降低。为了探究YAP的功能,我们使用YAP-siRNA沉默活化的HSC-T6细胞中的YAP,通过Western Blot,CCK-8实验,细胞周期实验和细胞凋亡实验证明了沉默YAP后,HSC-T6细胞的活化和增殖被抑制,但是促进了活化细胞的凋亡。为了继续探究YAP在MDI处理的细胞逆转中的作用,在MDI处理的细胞中使用SV40-YAP质粒过表达YAP,通过Western Blot发现YAP的过表达抑制了MDI对于活化的HSC-T6细胞的逆转作用。我们又使用了YAP的抑制剂维替泊芬(VP)进一步探究了YAP的功能,通过Western Blot,细胞增殖实验和细胞凋亡实验发现了VP抑制了HSC-T6细胞的活化,增殖,促进了凋亡,进一步证实了YAP的作用。在作用机制上,我们通过Western Blot检测了沉默YAP后Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因比如C-myc和cyclinD1的表达,发现YAP的沉默抑制了Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因(C-myc和cyclinD1)的蛋白表达,并且在MDI逆转的细胞中过表达YAP后,发现β-连环蛋白(β-catenin),C-myc和cyclinD1的蛋白表达升高,翻转了MDI对于Wnt/β-catenin信号通路的逆转作用,证明了YAP能够通过正向调控Wnt/β-catenin信号通路调节肝星状细胞的活化和增殖。本实验结果证明了YAP的沉默有助于肝纤维化的逆转,并且表明了YAP可能是HSCs激活和逆转的有效靶点。
【图文】：

果可知Vehicle Model Recovery图 1 小鼠肝脏图Fig.1 The figure of mouse liver果可知，正常组小鼠的肝脏肝小叶

Fig.2 HE staining were performed on liver tissue sections of mouse (×200sson 染色图中肝脏肝细胞发生大量的脂肪变性图 2 小鼠肝脏组织切片 HE 染色(×200)染色图中，正常组的小鼠肝脏肝小叶正常，无纤维组织肝脏肝细胞发生大量的脂肪变性，并且有大量的纤维组织无纤维组织并且有大量的纤维组织
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R575

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本文编号：2666100