原发性胆汁性肝硬化相关单抗1F9的抗原分离与鉴定

发布时间：2020-05-16 10:23

【摘要】：【背景】原发性胆汁性肝硬化（Primary biliary cirrhosis，PBC）是一种由自身免疫反应介导的、以肝内小胆管进行性破坏性、非化脓性炎症为特点的慢性肝内胆汁淤积性疾病，病程呈进行性，可发展至肝纤维化、肝硬化。近年来，由于对PBC认识程度和疾病诊断水平的提高，PBC检出率呈现逐年增高的趋势，作为非病毒性肝病，PBC的危害不容忽视。目前认为，PBC发病是遗传因素与环境因素相互作用的结果，但具体机制仍未阐明。由于PBC病人多表现为胆汁排泄障碍，我们尝试从胆汁排泄角度入手寻找与PBC发病相关的新分子。肝细胞是一种极性细胞，其胆管侧细胞膜上存在着多种特异性表达分布的酶、骨架蛋白、通道蛋白、离子交换体和转运体，共同参与肝细胞物质运输及胆汁排泄。有研究显示，PBC患者肝细胞胆管侧细胞膜极性分子存在结构和功能异常。 1F9单克隆抗体是本课题组前期以PBC患者肝细胞胆管侧膜性组分为免疫原，利用单克隆抗体技术筛选获得的PBC相关单克隆抗体之一。前期研究发现，该单抗所识别的抗原在正常肝脏组织中呈极性分布，主要位于肝细胞胆管侧；PBC患者肝脏组织中1F9抗原的表达随疾病进展逐渐增强，且部分患者中1F9抗原极性消失、分布紊乱，提示1F9抗原可能对PBC病理诊断具有重要意义。由于对1F9抗原认识有限，很大程度上限制了后续深入研究。因此，本研究拟在前期研究基础上，进一步明确1F9抗原与PBC的相关性，分离并鉴定1F9抗原，为后续机制研究奠定理论基础。【目的】 1、进一步明确1F9抗原与PBC的相关性；2、分离、鉴定1F9抗原。【方法】 1、采用免疫组织化学，研究1F9抗原在正常肝脏、PBC、乙型病毒性肝炎、药物性肝病、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病，共6种肝脏组织标本中的表达与分布，进一步明确1F9抗原与PBC的相关性。 2、检测并分析1F9单抗亚型，轻、重链可变区序列及二级空间结构；采用蛋白组学技术包括免疫沉淀、SDS-PAGE凝胶电泳和质谱分析（MALDI-TOF-TOF及LC-MS/MS），分离、鉴定1F9候选抗原。 3、通过免疫沉淀产物Western blot分析，验证1F9单抗与LAMP2单抗对对方抗原的交叉识别；通过连续组织切片免疫组化检测，观察1F9抗原与LAMP2在多种正常组织及PBC疾病组织中的表达与分布；通过免疫荧光/激光共聚焦，观察1F9抗原与LAMP2在细胞中的共定位情况；通过真核表达系统，观察1F9单抗对外源LAMP2蛋白的识别；通过免疫电镜技术，观察1F9抗原与LAMP2在正常肝脏及PBC疾病状态下的亚细胞定位。【结果】 1、对来源于2006年至2012年第四军医大学西京医院病理科的正常肝脏组织32例、PBC174例、乙型病毒性肝炎87例、药物性肝病44例、酒精性肝病23例、非酒精性脂肪性肝病53例，共6种石蜡包埋的肝脏组织标本进行切片、染色，观察1F9抗原在不同肝脏组织中的表达与分布。免疫组化结果显示，正常肝脏中，1F9抗原呈极性分布，主要位于肝细胞胆管侧；无胆汁淤积的肝脏疾病（乙型病毒性肝炎、药物性肝病、酒精性肝病和非酒精性脂肪性肝病）中，1F9抗原的表达与正常肝脏无明显变化；PBC患者肝脏中，1F9抗原的表达随疾病进展逐渐增强，约51%（88/174）的患者中1F9抗原呈现不同程度地分布紊乱、极性消失，弥漫性分布于肝细胞胞浆中，提示1F9抗原与PBC密切相关。 2、1F9单抗亚型为IgG1/κ，轻、重链可变区序列及二级结构已明确。肝癌细胞系HepG2和肾小管上皮细胞系HK2中1F9抗原呈阳性表达。选择HepG2和HK2两株细胞系，利用1F9单抗进行免疫沉淀富集1F9抗原，免疫沉淀产物经SDS-PAGE凝胶电泳分离后分别进行银染和Western blot验证。银染结果显示，两株细胞系中均成功富集到~110kDa的蛋白带，Western blot证实该蛋白带可被1F9单抗特异性识别。分别对两株细胞系中富集到的~110kDa蛋白带进行切胶、酶解，同时利用两种质谱分析方法MALDI-TOF-TOF和LC-MS/MS进行检测，通过生物信息学检索，结合分子量、组织分布等信息，获得1F9候选抗原Lysosome-associated membraneglycoprotein2（LAMP2）。 3、经鉴定，现已明确1F9抗原为LAMP2：①HepG2和HK2两株细胞系中，1F9单抗免疫沉淀的蛋白可被1F9单抗、LAMP2单抗特异性识别，而不能被LAMP1（LAMP1为LAMP2同源分子）单抗识别；同时，LAMP2单抗免疫沉淀的蛋白也可被1F9单抗、LAMP2单抗特异性识别，且不能被LAMP1单抗识别；②免疫组化结果显示，1F9抗原和LAMP2在多种连续正常组织及PBC组织中的表达、分布相似；③免疫荧光/激光共聚焦结果证实，HepG2和HK2细胞系中，1F9抗原与LAMP2呈现良好的共定位现象；④犬肾上皮细胞系MDCK中1F9抗原和LAMP2均不表达，分别将LAMP1质粒和LAMP2质粒瞬时转染MDCK细胞，提取细胞总蛋白进行Western blot分析，结果显示1F9单抗可以识别外源表达的LAMP2蛋白，而不能识别外源表达的LAMP1蛋白；⑤免疫电镜结果显示，正常肝脏中，1F9抗原与LAMP2定位相似，主要分布于肝细胞胆管侧细胞膜附近的囊泡膜，囊泡直径大小从50至400纳米不等；PBC患者肝组织中，LAMP2表达增强、分布紊乱的特点也与1F9抗原相似，具体表现为：PBC中，囊泡数量明显增多，标记有胶体金颗粒的囊泡弥漫性分布于整个细胞浆，且胶体金颗粒除分布于囊泡膜外，囊泡腔内也出现胶体金颗粒聚集，同时，肝细胞胞浆内还存在一部分与囊泡毫无关系的可溶性LAMP2分子（散在分布的胶体金颗粒）。【结论】本研究进一步证实了1F9抗原与PBC的相关性：①PBC患者肝脏中，1F9抗原表达增强；②1F9抗原表达增强与PBC病理分级正相关；③51%（88/174）的PBC患者肝脏中，1F9抗原呈现不同程度地分布紊乱、极性消失。本研究明确了1F9单抗亚型，轻、重链可变区序列及二级空间结构，并最终证实1F9抗原为LAMP2：①通过免疫沉淀——质谱分析（MALDI-TOF-TOF及LC-MS/MS方法）策略，获得1F9候选抗原LAMP2；②通过免疫沉淀产物Western blot分析，证实1F9单抗与LAMP2单抗可以相互识别对方抗原；③通过连续组织切片免疫组化检测，证实1F9抗原与LAMP2在多种正常组织和PBC疾病组织中的表达、分布一致；④通过免疫荧光/激光共聚焦，证实1F9抗原与LAMP2在细胞系中共定位良好；⑤通过LAMP2真核表达产物Western blot分析，证实1F9单抗可以识别外源表达的LAMP2蛋白；⑥通过免疫电镜技术，证实1F9抗原与LAMP2在正常肝脏组织及PBC疾病状态下的亚细胞定位相似。
【图文】：

内体,极性,胆汁排泄,顶端

内体在上皮细胞极性形成中起重要作用[42]另有研究显示，内体与肝细胞胆汁排泄密切相关。HepG2 细胞中，，SAC 通过不同的运输通路，参与神经鞘脂类似物[C6NBD-sphingomylin(SM)、C6NBD-glucosylceramide (GlcCer)]向顶端膜运输，进而参与顶端膜形成[29]。其次，BSEP 和 MRP2 是肝细胞顶端膜中与胆汁排泄密切相关的 ABC 转运体，WIF-B9 细胞极性形成过程中，rab11a 阳性循环内体不仅参与顶端膜形成，并且通过介导 BSEP 和 MRP2 向顶端膜运输，影响胆汁排泄[43]。（三）、肝细胞胆管侧极性分子异常与多种胆汁淤积性疾病密切相关肝细胞胆管侧极性分子异常与多种胆汁淤积性疾病密切相关（见表 2），如：进行性家族性肝内胆汁淤积症 1-3 型（PFIC1-3）、原发性胆汁性肝硬化（PBC）、原发性硬化性胆管炎（PSC）、Dubin Johnson 综合症、Wilson 氏

败血症,胆汁淤积,肝细胞,胆管

第四军医大学硕士学位论文示肝外胆汁淤积引起肝细胞 AQP8 转录后蛋白水平下调[75]。同时，败血症相关胆汁淤积症（Sepsis-associated cholestasis）大鼠中，AQP8 蛋白表达下降，也出现 AQP8 mRNA 表达水平反应性增高现象[76]。对于败血症相关胆汁淤积症的发病机制[77, 78]，有研究认为细菌脂多糖（Lipopolysaccharides ，LPS）诱导肝脏 Kupffer 细胞释放 TNFα等炎性细胞因子，继而通过诱导溶酶体和蛋白酶体对 AQP8 的降解实现对 AQP8 的转录后调控（图 2）。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R575.2

【共引文献】