阿魏酸联合脂肪间充质干细胞体外促肝星状细胞凋亡及机制的研究

发布时间：2020-05-16 14:29

【摘要】：目的:本实验研究阿魏酸(Ferulic acid,FA)联用大鼠脂肪间充质干细胞(Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells,ADMSCs)对活化大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)凋亡的影响。进一步探讨两者协同促HSCs凋亡作用机制,是否通过调节肝星状细胞的TGF-β/Smad信号通路来实现。方法:1、FA最佳药物作用浓度的确定:(1)用完全培养基将HSCs培养至细胞密度达60%-70%时,换无血清培养基,分别培养6h、12h、24h、36h、48h,用四甲基偶氮哇蓝(MTT)法测HSCs的OD值,绘制HSCs生长曲线并确定最适细胞培养时间。(2)用完全培养基将HSCs培养至细胞密度约60%-70%时,换用含不同浓度(25-800μg/m L)FA的无血清培养基处理HSCs,用MTT法测HSCs的细胞增殖抑制率,并计算IC50,确定FA的最佳药物作用浓度。(3)用完全培养基将ADMSCs培养至细胞密度达60%-70%时,换为无血清培养,用MTT法检测FA对ADMSCs的存活率的影响。2、实验分组:利用Transwell半透膜对ADMSCs和HSCs以1:5的比例建立上下层间接共培养体系,当两者细胞在完全培养基中达到60%-70%密度时,换为无血清培养,然后将HSCs分为4组:(1)空白对照组:HSCs单独培养,不加FA和ADMSCs;(2)FA条件对照组:加入FA处理HSCs;(3)ADMSCs条件对照组:加入ADMSCs,用Transwell建立上下双层细胞共培养体系。ADMSCs在上层Transwell中培养,HSCs在下层6孔板中培养;(4)FA/ADMSCs实验组:在ADMSCs与HSCs共培养体系中加入FA共同作用。3、阿魏酸联合脂肪间充质干细胞对肝星状细胞凋亡的影响:用流式细胞仪检测各组HSCs的凋亡率;用酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组HSCs上清液中CollagenⅠ的含量。4、阿魏酸联合脂肪间充质干细胞促肝星状细胞对肝星状细胞相关TGF-β/Smad通路研究:利用q RT PCR检测各组HSCs中TGF-β1、Smad2、Smad3和Smad7 m RNA的表达水平;Western blot检测各组HSCs中TGF-β1和Smad7蛋白、Smad2/3磷酸化(p-Smad2/3)表达变化。结果:1、MTT结果显示:本实验换为无血清条件后的最适细胞培养时间为24h;不同浓度FA作用24h后,与未加FA的对照组比较,实验组HSCs生长抑制率均显著升高(P0.05)。用SPSS22.0软件中文版计算出IC50=243μg/m L。结合本课题前期实验,确定FA的最终药物处理浓度为200μg/m L;MTT实验结果提示此浓度的FA对ADMSCs的存活率影响不明显2、流式细胞仪测HSCs凋亡率结果示:与空白对照组比较,ADMSCs组中HSCs凋亡率变化无明显统计学差异;FA组、FA/ADMSCs实验组HSCs的凋亡率均明显增高(P0.05)。与两条件对照组比较,FA/ADMSCs实验组中HSCs的凋亡率均显著升高(P0.05)。ELISA结果显示:在无血清条件下,各组HSCs培养24h后,培养上清液中的Collagen I的浓度出现了差异。与空白对照组组比较,ADMSCs组中Collagen I的浓度变化无明显统计学差异;FA组、FA/ADMSCs实验组HSCs的Collagen I浓度均显著降低(P0.001)。与FA组和ADMSCs组两条件对照组比较,FA/ADMSCs实验组上清中的Collagen I含量显著降低(P0.05或P0.001)。3、q RT PCR和Western blot检测对肝星状细胞TGF-β/Smad信号转导通路结果显示:与空白和条件对照组比较:FA/ADMSCs实验组中HSCs的TGF-β1、Smad2、Smad3m RNA表达明显下降,Smad7 m RNA表达明显升高(P0.05或P0.01);FA/ADMSCs实验组中HSCs的TGF-β1蛋白表达、Smad2/3磷酸化水平显著降低,而Smad7蛋白表达水平显著升高(P0.05)。结论:阿魏酸联合脂肪间充质干细胞促肝星状细胞的凋亡机制可能是下调肝星状细胞中TGF-β1表达,进而导致下游Smad2/3磷酸化活性下降以及Smad7表达升高,促进细胞凋亡。
【图文】：

西 南 医 科 大 学 硕 士 学 位 论 文第一部分实验结果1 HSCs 细胞形态及生长状态刚复苏或传代后的 HSCs 在倒置显微镜下观察呈圆形，使用含 10%FBS的 DMEM/F-12 培养液培养 6h 后已基本贴壁。培养 12h 后呈扁圆形或椭圆形，一部分细胞开始伸展出现伪足（如图 1-A 所示）。培养 24h 后细胞已完全伸展呈不规则的三角形或多角形（如图 1-B 所示）。培养 24h 后细胞质中可见许多折光颗粒，，细胞呈团生长（如图 1-C 所示）。HSCs 细胞增殖较快，培养 72h 左右即长满瓶底（如图 1-D 所示）。

西 南 医 科 大 学 硕 士 学 位 论 文2 ADMSCs 细胞形态及生长状态刚复苏的第三代 ADMSCs 在倒置显微镜下观察呈圆形，使用含10%FBS 的 DMEM/F-12 培养液培养 6h 后逐渐贴壁。培养 12h 后细胞大多数细胞已贴壁，呈短梭形。培养 24h 后细胞逐渐变长。培养 48h 后细胞部分细胞呈纺锤形，细胞体积逐渐增大(见图 2-A)。培养 4-5 天后细胞体积较大，呈长梭形，呈漩涡状生长，细胞已达到 80%-90%融合(见图 2-B)，按1:3 传代，传至第五代冻存备用。
【学位授予单位】：西南医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R575

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1 张宗h

本文编号：2666875