纳米细菌对人正常肝细胞生物学形态的影响和机制探讨

发布时间：2020-05-21 09:04

【摘要】： 第一部分病毒性肝炎后肝硬化组织中纳米细菌的检测、分离、鉴定与培养目的:检测病毒性肝炎后肝硬化组织中是否存在纳米细菌,并对可能存在的纳米细菌进行分离、鉴定及培养。方法:手术中获取的12例病毒性肝炎后肝硬化组织及12例正常肝组织标本,分别切取部分存于4%中性甲醛溶液中作石蜡包埋切片,以免疫组化法作纳米细菌检测。其余液氮速冻后存于—70℃冰箱,留作纳米细菌的分离,纳米细菌单克隆抗体间接免疫荧光法和电镜检测进行鉴定。对分离的纳米细菌进行培养,培养过程中检测电解质及葡萄糖浓度的变化。结果:12例病毒性肝炎后肝硬化组织中10例纳米细菌检测阳性,2例阴性,12例正常肝组织中1例纳米细菌检测阳性,11例阴性,肝硬化组织中纳米细菌感染率高于正常肝组织(P＜0.05)。纳米细菌单克隆抗体间接免疫荧光法检测时,纳米细菌可发出绿色荧光。透射电镜下测量纳米细菌直径大小约为100～300nm。纳米细菌培养过程中,K~+、Na~+、Cl~-、Mg~(2+)及葡萄糖的浓度无明显变化(P＞0.05),而Ca~(2+)、P~(3-)浓度进行性下降,每周检测结果比较存在显著性差异(P＜0.05)。结论:病毒性肝炎后肝硬化组织中存在纳米细菌。纳米细菌单克隆抗体间接免疫荧光法快速准确鉴定纳米细菌,电镜有助于纳米细菌检测。纳米细菌培养生长过程中消耗Ca~(2+)、P~(3-),而不利用K~+、Na~+、Cl~-、Mg~(2+)及葡萄糖。第二部分纳米细菌对人正常肝细胞生物学形态的影响目的:观察纳米细菌对人正常肝细胞生物学形态的变化及是否有损伤作用。方法:光镜下观察不同浓度纳米细菌作用于人正常肝细胞24小时和48小时后生物学形态的改变;MTT比色实验和LDH释放试验检测不同浓度纳米细菌作用后人正常肝细胞存活和增殖情况,并检测不同时间点NO的变化。结果:不同浓度纳米细菌作用后,光镜下观察人正常肝细胞形态存在不同程度改变,极低浓度时(OD=0.001,0.009)无明显变化,随浓度增加和作用时间延长,正常肝细胞外观上逐渐出现细胞容量增加,肿胀,轮廓不清,细胞膜损伤破裂,甚至完全解体而无细胞结构。不同浓度纳米细菌作用48小时后:除OD=0.001组外,各浓度组MTT值低于对照组MTT值,存在显著性差异(P＜0.05),各浓度组之间比较存在显著性差异(P＜0.05)。作用72小时后:OD=0.137组和OD=0.246组的MTT值比较无显著性差异(P＞0.05),其余各浓度组之间比较仍存在显著性差异(P＜0.05)。比较不同时间点(48小时和72小时):OD=0.001,0.009时72小时的MTT值高于48小时的MTT值(P＜0.05)。OD=0.018,0.031,0.048,0.137时72小时的MTT值低于48小时的MTT值(P＜0.05)。OD=0.246时48小时的MTT值和72小时的MTT值比较无显著性差异(P＞0.05)。不同浓度纳米细菌作用于正常肝细胞时的LDH值差异有统计学意义(F=712.064,P＜0.01),不同时间点的LDH值差异有统计学意义(F=432.120,P＜0.01)。纳米细菌浓度与作用时间之间存在交互效应(F=217.308,P＜0.01)。与正常肝细胞组相比较,除OD=0.001组纳米细菌与其差异无统计学意义(P=0.835)外,其余各组之间两两比较,差异均有统计学意义(P＜0.05)。随着纳米细菌浓度的逐步提高,各时间点LDH从细胞内释放的量逐渐升高,并与0小时比较存在显著性差异(P＜0.05)。NO检测:不同浓度纳米细菌作用于人正常肝细胞时,除OD=0.001组与正常肝细胞对照组差异无统计学意义外(P=0.206),其余各组与对照组及不同浓度NB组两两比较均有统计学意义(P＜0.05)。不同时间点两两比较差异均有统计学意义(P＜0.001)。纳米细菌浓度与作用时间之间有交互作用(F=625.454,P＜0.001)。结论:纳米细菌可以损伤人正常肝细胞,随着浓度升高及作用时间延长,损伤程度越重,且在作用过程中产生NO,存在着浓度和时间依赖关系。第三部分纳米细菌损伤人正常肝细胞机制的初步探讨目的:探讨纳米细菌对人正常肝细胞的损伤机制。方法:采用线粒体探针观察不同浓度纳米细菌作用人正常肝细胞时,在不同时间点线粒体通透性孔道的开放情况,并结合电镜下线粒体超微结构的改变,三磷酸腺苷检测和流式细胞仪检测。结果:(1)OD=0.001纳米细菌作用于正常肝细胞6小时后,即可以观察到线粒体瞬时通透性孔道有一定程度的开放,部分线粒体跨膜电位出现下降。随着作用时间的延长,更多的线粒体瞬时通透性孔道进一步开放,至36小时,钙黄绿素荧光强度进一步减弱,MitoTracker CMXRos荧光由于线粒体的崩解,弥散分布于细胞内。48小时,整个视野的钙黄绿素荧光强度明显黯淡,MitoTrackerCMXRos荧光在细胞内的分布显得紊乱,无法分辨线粒体外形。结合同时间点电镜图片可以发现此时的线粒体出现明显的嵴丢失及空泡化。至72小时,几乎无钙黄绿素荧光,视野的底色显示为荧光染料的残迹,MitoTracker CMXRos荧光强度黯淡,分布于细胞质内散在聚集,线粒体跨膜电位完全消失。整个过程中,细胞核仍然维持完整。OD=0.246纳米细菌作用于正常肝细胞3小时即可观察到PTP开放,6小时即可以看到钙黄绿素荧光明显减弱,线粒体跨膜电位已经开始出现下降。12小时,钙黄绿素荧光进一步减弱,部分线粒体跨膜电位的降低及消失。14小时,线粒体已经破裂,MitoTracker CMXRos荧光染料外溢至细胞质内。16小时,钙黄绿素荧光基本消失,大部分线粒体的跨膜电位消失。24小时,仅仅残留着钙黄绿素荧光染料及MitoTracker CMXRos染料痕迹,已无完整的细胞核及细胞形态。 (2)OD=0.001纳米细菌作用于正常肝细胞36小时,电镜下可以看到细胞内大部分线粒体已经广泛空泡化,嵴丢失。在OD=0.246作用正常肝细胞12小时,电镜下观察到线粒体变得肿胀,嵴结构紊乱,16小时则观察到肝细胞线粒体均已经空泡化,但是细胞核仍维持完整。 (3)OD=0.246组纳米细菌攻击正常肝细胞6小时引起凋亡。OD=0.001组纳米细菌作用于正常肝细胞24小时,细胞凋亡。OD=0.018组纳米细菌作用24小时仅仅出现一个较低的凋亡峰。 (4)三磷酸腺苷检测:不同浓度的纳米细菌作用人正常肝细胞时RLU值有统计学意义(F=7.808,P=0.013)。正常肝细胞组与OD=0.001,0.018组之间RLU值差异无统计学意义(P=0.614,0.213),而与OD=0.048,0.137及0.246组之间均有统计学意义(P=0.034,0.004,0.004)。OD=0.137与0.246组之间差异无统计学意义(P=0.970)。不同时间点之间RLU差异有统计学显著意义(F=251.181,P＜0.001),除0.5小时与0小时(P=0.144),0.5小时与1小时之间(P=0.053),6小时与48小时(P=0.080),12小时与24小时之间(P=0.366)之间差异无统计学意义外,余各时间点两两比较RLU值差异均有统计学意义(P＜0.05)。纳米细菌浓度与攻击时间有交互作用(F=142.551,P＜0.001)。结论: 1.纳米细菌对于人正常肝细胞的损伤是通过诱导线粒体瞬时通透性孔道的开放实现的。 2.纳米细菌作用于人正常肝细胞会产生凋亡,随着纳米细菌浓度的升高及作用时间的延长,会从凋亡转为坏死。在此过程中,线粒体瞬时通透性孔道的开放和三磷酸腺苷的消耗决定了细胞最终的命运是凋亡还是坏死。
【图文】：

透射电镜,透射电镜

论性肝炎后肝硬化组织中纳米细菌的发现、鉴定及意义纳米细菌是革兰氏阴性菌，蛋白细菌类，呈球状或球杆状，细胞壁厚，鞭毛，卜内疏胺酶(队别比别吐姗)阴性，体积极小，具有独特的矿化能值7.4环境中和生理钙浓度状况下可以形成磷灰石外壳搜盖在菌体周所谓生物膜，在高温强酸等许多徽生物难以生存的条件下生存。纳米细病性，通过分泌一些细胞毒素及细胞因子(如内毒素、脂多糖、白细胞，引起被感染细胞死亡。研究表明纳米细菌与多种疾病相关如泌尿系2-1习，肝胆系统疾病f’，l刀，肿瘤11‘切，艾滋病脚洲，动脉粥样硬化12兑刀，口‘翔等。体外实验表明纳米细菌能够结合哺乳动物细胞，通过内吞作细胞内，给哺乳动物静脉注射纳米细菌可以经尿路排出，在大鼠可以管和肾乳头上皮细胞凋亡和脱落1311。我们前期用胎牛血清分离培养的

曲线,作用时间,细胞损伤,统计学意义

方程检验卜31.642，产0.000，有统计学意义，比较纳米细菌浓度和作用时间二者的标准回归系数夕，说明纳米细菌浓度(0.545)对细胞损伤的影响大于作用时间(0.352)。从图27，28可以看到，OD二0.oo1NB纳米细菌正常肝细胞时，LDH的变化不大。随着纳米细菌浓度的逐步提高，，各时间点LDH从细胞内释放的量逐渐升高，并与0小时比较存在显著性差异(P<0.05)。此外，OD二0.246组NB在24小时达到曲线最高值，而在48小时即明显下降
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R512.6;R575.2

【参考文献】