【摘要】： 急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是临床常见的急腹症之一,特别是重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)来势凶猛,病程进展快,合并感染的病死率可高达25%。大量研究显示,肠道黏膜屏障损伤及其介导的病理改变在其发病过程中起到了关键的作用。AP时肠道屏障功能受到损害会直接导致细菌和内毒移位,引起肠源性感染和内毒素血症,并进一步激发全身炎症反应综合征( systemic- inflammatory response syndrome,SIRS)和多器官功能障碍综合征(multiple organ disfunction syndrome, MODS)。 Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是细胞表面一类受体,它在炎症、免疫、病源体识别中都起着十分重要的作用。其中Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)作为LPS受体可识别来自G-细菌的LPS,其与急性胰腺炎相关肠道损伤的关联性已得到证实,并逐渐引起重视。已知TLR4是发现最早的TLRs亚型之一,近十几年来对其研究最多,其信号传导通路也最为明确,某种因素激活TLR4后,通过一系列信号传导,产生炎症放大效应。 TLR4介导的信号转导包括MyD88依赖性和非依赖性途径;TLR4主要通过MyD88依赖性途径,MyD88依赖性途径主要介导核因子-κΒ(NF-κΒ)活化、细胞因子的产生。研究表明急性胰腺炎时肠道微血管内皮细胞和白细胞内的黏膜固有层TLR4的表达增多。马继民等研究发现急性胰腺炎时肠黏膜TLR4的表达水平与肠黏膜通透性指数明显相关,与肠黏膜的病理学改变也呈相关性。目前已经研制出TLR4单克隆抗体(TLR4mAb),并将其应用至溃疡性结肠炎小鼠身上,发现其能减轻溃疡性结肠炎的病情。因此我们也推测将TLR4mAb注入急性胰腺炎大鼠的腹腔内也会减轻胰腺炎对肠黏膜的损伤。 目的: 本研究通过建立大鼠AP模型,并给予TLR4mAb,观察肠道病理学、二胺氧化酶(DAO)活性变化、TLR4和NF-κΒp65蛋白表达以及炎性介质TNF-α、IL-6的释放,探讨TLR4在急性胰腺炎相关性肠道损伤中的作用,并探讨TLR4单克隆抗体对急性胰腺炎肠黏膜损伤的治疗效果。 方法: 1动物模型的制备 选取雄性大鼠,以10%水合氯醛腹腔注射麻醉,取上腹正中作切口进入腹腔,用4号加工钝头头皮静脉针头于十二指肠乳头附近逆行插入胰胆管,以0.2ml/min速度注入5%牛磺胆酸钠(0.1ml/100g),推药后捏闭胰胆管入十二指肠处,观察3min,剪除结扎线,关腹。 2实验分组 将雄性wistar大鼠18只,随机分为假手术组(SO组, n=6)、急性胰腺炎组(AP组,n=6)、TLR4单克隆抗体治疗组(TLR4mAb组,n=6)。TLR4mAb于造模后立即经腹腔注射,剂量为50μg/只。 3生化指标测定取血清样本,采用全自动血清生化分析仪检测血清淀粉酶、脂肪酶活性,由河北医科大学第二医院生化室协助测定。 4胰腺、肠道组织病理学 采用石蜡切片,HE染色。 5 DAO活力测定 取肠组织制成组织匀浆,采用1995年黎君友等改良的分光光度法,检测肠组织匀浆二胺氧化酶(DAO)活性。 6肠组织TNF-α、IL-6的测定 取肠组织制成匀浆,严格按照大鼠放射免疫试剂盒说明书要求检测。 7免疫组织化学染色测定肠组织TLR4、NF-kBp65表达: 脱蜡至水,抗原热修复后,用3%过氧化氢孵育15min。封闭一抗4℃过夜,阴性对照用PBS代替一抗。先后滴加二抗、三抗各15min,后用3,3-二氨基苯联胺(DAB)显色,复染后封片。以细胞浆内呈现黄褐色颗粒为阳性表达,并进行免疫组化评分。 8 western bloting法测定 肠组织TLR4、NF-kBp65表达:100mg肠组织经匀浆器彻底粉碎,加入1ml细胞裂解液,充分裂解,提取TLR4膜蛋白(具体操作按说明书),和NF-κΒp65胞浆蛋白,分别取100μg与上样缓冲液充分混合,置于SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,转移至NC膜,以5%的脱脂奶粉封闭,一抗(1:250)4C孵育过夜,以相应的二抗室温下孵育2h,抗体检测按Santa Cruz公司试剂盒说明书进行。 结果: 1血清淀粉酶、脂肪酶变化与SO组比较,在AP组和TLR4mAb组血清淀粉酶和血清脂肪酶水平均显著升高(P0.05)。与AP组比较,TLR4mAb组血清淀粉酶和脂肪酶水平均降低(P0.05)。 2胰腺的病理学变化 在SO组胰腺及周围组织结构大致正常;AP组和TLR4 mAb组,胰腺及周围组织水肿、出血和坏死,腹腔出现血性腹水。 3肠组织病理学变化 SO组肠组织结构大致正常。AP组和TLR4mAb组,可见肠道充血、水肿,蠕动减弱,炎细胞浸润伴点状出血,并有淋巴滤泡增生,绒毛出现水肿增粗,甚至坏死脱落。 4肠组织匀浆DAO活力变化 与SO组相比,AP组与TLR4mAb组DAO活力明显下降(P0.05)。与AP组相比,TLR4mAb组DAO活力明显上升(P 0.05)。 5肠组织匀浆TNF-α、IL-6测定 与SO组相比,在AP组和TLR4mAb组TNF-α、IL-6水平均显著升高(P0.05)。与AP组比较,在TLR4mAb组TNF-α、IL-6水平显著降低(P0.05)。 6免疫组化测定 TLR4在肠组织中的表达:与SO组相比,AP组与TLR4mAb组TLR4表达明显增强(P0.05)。AP组在的回肠黏膜表面,黏膜固有层的淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸粒细胞,黏膜下层的动静脉、纵形和环形肌层等处都有比较强的TLR4表达,免疫组化评分显示,TLR4mAb组表达强度低于AP组(P 0.05)。 肠组织NF-κΒp65活化:与SO组相比,AP组与TLR4mAb组NF-κΒp65活性明显增强(P0.05)。AP组肠黏膜可见大量细胞核呈棕褐色染色的阳性细胞,主要为肠绒毛顶端的肠上皮细胞和靠近肠绒毛顶端的单核细胞,TLR4mAb组表达强度低于AP组(P 0.05)。 7 western bloting测定 TLR4在肠组织中的表达:光密度扫描分析显示,在SO组肠组织有弱的TLR4表达,AP组和TLR4mAb组TLR4表达明显增强(P 0.05)。与AP组相比,在TLR4mAb组表达减弱(P 0.05)。 NF-κΒp65在肠组织中的表达:光密度扫描分析显示,在SO组肠组织有弱的NF-κΒp65表达,在AP组、TLR4mAb组NF-κΒp65表达均明显增强(P0.05)。与AP组相比,TLR4mAb组NF-κΒp65表达减弱(P 0.05)。 结论: 1逆行胆胰管内注射5%牛磺胆酸钠,通过检测血清淀粉酶、脂肪酶升高,胰腺组织HE染色观察到胰腺及周围组织水肿、出血和坏死,肠组织水肿、充血、出血,DAO活性下降,标明AP大鼠存在相关性肠道损伤。 2在AP大鼠肠组织中,TLR4及下游通路中NF-κΒp65表达均明显高于对照组,表明TLR4介导的信号转导途径在AP相关性肠道损伤中可能发挥作用。 3 TLR4mAb是近年来发明的TLR4单克隆抗体,能降低TLR4及下游通路中NF-κΒp65表达,改善肠黏膜通透性和炎症损伤,认为TLR4单克隆抗体对大鼠AP相关性肠道损伤有治疗作用。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R576
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本文编号：
2675040
