小鼠小肠胰岛素分泌情况及冷刺激和运动对非酒精性脂肪肝的作用研究

发布时间：2020-05-31 12:33

【摘要】：目的:第一部分:有研究表明,胰腺以外的组织在糖尿病的生理病理过程中也起到一定的作用。肠源激素对胰岛细胞有很大影响,并且在糖尿病发病过程中有一定的作用。在之前的研究中我们发现鼠的小肠有胰岛素原基因的表达。在本研究第一部分中,我们通过形态学的方法确定小肠中胰岛素合成的具体部位,从基因和蛋白质水平证明小肠中有胰岛素的表达,同时研究不同肠段的胰岛素表达水平是否存在差异,为进一步研究肠源胰岛素对胰腺细胞的影响及糖尿病发病过程中的作用奠定基础。第二部分:冷刺激和运动的干预会使得小鼠肝脏的基因表达改变,有利于加速脂肪和糖类代谢。冷刺激所引起的肌肉战栗与运动时骨骼肌收缩相似可以介导白色脂肪棕色化。因此,第二部分我们将探究冷刺激和运动对非酒精性脂肪性肝病的影响。方法:第一部分:我们以健康的6周龄C57BL/6J小鼠的小肠为研究对象,处死前禁食8h,测量小鼠的血糖值,脱颈处死小鼠后,将小鼠的小肠按照十二指肠,空肠,回肠分别取样,小鼠小肠组织长度大约在24-30cm左右,其中十二指肠,空肠,回肠大约各占全长的三分之一。将剪取的组织样本制成石蜡包埋切片,通过免疫荧光实验检测有胰岛素存在的部位。从组织样本中提取总RNA,反转录成cDNA,通过实时荧光定量PCR检测胰岛素mRNA在不同肠道组织中的相对表达量。对组织中提取的蛋白质样本进行蛋白免疫印迹电泳实验,检测小肠中是否有胰岛素蛋白存在、各肠段表达量是否有差异。第二部分:选取6周龄C57BL/6J雄性小鼠24只,6周龄KKay自发性雄性肥胖小鼠24只,将其分别分为4组:常温组,常温运动组,冷刺激组,冷刺激运动组。C57BL/6J小鼠给予普通饮食,KKay自发性肥胖小鼠给予KKay小鼠高脂饮食。利用高通量测序及GEO数据库分析确定要检测的差异基因,再通过荧光定量PCR和蛋白免疫印迹电泳检测不同组别的肝脏基因表达有何种变化,结果:免疫荧光检测结果显示,在小鼠小肠的肠绒毛及肠隐窝有胰岛素、PDX1及ICA-512的表达,在同一肠段内胰岛素表达的位置和表达量未见明显差异。电子扫描显微镜观察发现小肠隐窝附近的细胞内有类似胰岛素的分泌颗粒。实时荧光定量PCR显示小鼠小肠内有胰岛素的mRNA表达,空肠表达量稍高。蛋白质水平的蛋白免疫印迹电泳实验也证实了小肠细胞内有胰岛素蛋白质存在,而其表达水平差异同mRNA的表达水平差异一致。实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹电泳均显示出在冷刺激和运动的干预下,小鼠的肝脏基因表达出现了变化,与脂肪及能量代谢相关的基因如FASN和AMPK的表达量明显上调。结论:小肠中有胰岛素基因表达,同时也发现有胰岛素蛋白存在。由于胰岛素在其正常的生理过程中不存在进入细胞膜的过程,所以我们可以认为,在小肠细胞内发现的胰岛素蛋白为小肠细胞自身合成得,而不是从胰腺转运来的。我们还发现在小肠中,以空肠的胰岛素合成量最多,十二指肠和回肠比空肠略低,且在正常血糖水平下三者都远低于胰腺的胰岛素表达量;我们之前的研究也发现,肠源胰岛素的分泌高峰同胰腺胰岛素不同,因此我们猜测肠源胰岛素可能具有同胰腺胰岛素不同的作用。冷刺激和运动使得肝脏的FASN和AMPK表达上升,AMPK磷酸化增加,在促进脂肪代谢,控制体重方面有着重要的作用,冷刺激与运动相结合的干预方式也为控制体重、预防肥胖及其相关代谢性疾病的发生提供了一种新思路。
【图文】：

胰岛素,胰腺,放大倍数,十二指肠

15 1：A，在十二指肠(duodenum),空肠(jejunum)，回肠(ileum)及胰腺中检测到的胰岛素DX1，有部分细胞呈胰岛素、PDX1 双阳性，放大倍数 1000 倍。B，小肠及胰腺中检测到ICA-512，放大倍数 400 倍。

胰岛素分泌,小肠,电镜检测,肌肉层

空肠(图 2B)，回肠(图2C)中都存在类似胰岛素的分泌颗粒，表达量上并无明显差异。结合上述免疫荧光检测的结果，形态学观察表明小肠中的胰岛素存在于细胞内部，众所周知，胰岛素是作用在细胞表面胰岛素受体的一种蛋白质，胰岛素在完成生理作用的过程中会同细胞表面的胰岛素受体结合，而不会进入细胞，所以可以认为，我们检测到的胰岛素是由小肠细胞自身合成的，，并非由胰岛 β细胞合成再经血液转运而来。图 2：电镜检测小肠中的胰岛素分泌颗粒，→所指为胰岛素分泌颗粒，N 为细胞核，ML 为肌肉层，IC 为小肠隐窝。1.3.3 荧光定量 PCR &蛋白免疫印迹电泳检测显示小肠有胰岛素存在我们以 β-actin 为内参，实时荧光定量 PCR 检测十二指肠、空肠、回肠和胰腺中胰岛素 mRNA 的相对表达量(图 3A)。空肠与十二指肠和回肠的胰岛素相对表达量的差异具有统计学意义（P 小于 0.05），小肠组织与胰腺之间差异极为明显（P 小于 0.01）。通过蛋白免疫印迹电泳对小肠中胰岛素表达量的检测得到了和实时荧光定量 PCR 相一致的结果(图 3B)，选取 GAPDH 作为内参
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R575.5

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