PDTC对暴发性肝衰竭大鼠肝组织NF-κB及其调控炎症细胞因子的影响

发布时间：2020-06-01 13:05

【摘要】： 目的:暴发性肝衰竭(fulminant hepatic failure,FHF)是一种由多种原因引起的肝细胞急性大量坏死和严重肝功能损伤所致的临床综合征。暴发性肝衰竭具有起病急,病情进展快,并发症多,治疗难度大,死亡率高,预后极差的特点,是当前肝病研究的热点和难点。其发病机制非常复杂,迄今未能完全阐明。在我国,引起FHF的病因主要是病毒性肝炎,其次是药物和中毒等因素。目前的研究认为,细胞因子网络的激活在暴发性肝衰竭的发病机制中起着重要作用。其中核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)在暴发性肝衰竭炎症反应中的重要调控作用已被证实,NF-κB是一类重要的转录调控因子,被认为是调节前炎症因子基因表达的关键成分之一,诱导炎症细胞因子、趋化因子、黏附分子、炎性酶等的表达,在多种炎症性疾病的炎症部位高度活化。已有研究证实,在肝脏炎症、纤维化、肝细胞凋亡与再生、肝脏缺血再灌注损伤等病理生理过程中均伴有NF-κB的活化,是调控肝脏病理损害重要的转录因子。肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)是炎症反应的重要介质,在很多炎症反应中均有它们的活化和表达。TNF-α本身是NF-κB的激活剂,而NF-κB的活化又能促进TNF-α的活化和释放,形成一个恶性循环。TNF-α和NF-κB的活化皆能诱导iNOS,从而引起一氧化氮(nitric oxide, NO)释放,形成级联瀑布效应,促进肝损伤和发展,从而引起肝细胞大量坏死。吡咯烷二硫代氨基甲酸(pyrrolidine dithiocarbamate, PDTC)是一种抗氧化剂,能特异性抑制NF-κB活化。但抑制NF-κB的活化对暴发性肝衰竭病情进展的影响如何?研究甚少。本研究基于上述理论,检测D-氨基半乳糖(D-galactosamine, D-GalN)和脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)导致的大鼠暴发性肝衰竭及应用PDTC后肝组织NF-κB、TNF-α和iNOS的表达情况,分析NF-κB与肝细胞损伤程度、TNF-α、iNOS的关系,探讨PDTC抑制NF-κB表达对大鼠暴发性肝衰竭炎症损伤的影响及其分子机制,从分子生物学角度进一步证实NF-κB在暴发性肝衰竭炎症损伤中的作用,为临床如何调节NF-κB表达治疗暴发性肝衰竭提供理论依据。方法:1研究对象:雄性清洁级Wistar大鼠60只,体重180-200g。将大鼠随机分为模型组30只,PDTC组30只。模型组腹腔注射D-GalN800mg/kg,之后立即皮内注射LPS10μg/kg,制造暴发性肝衰竭模型。PDTC组制作FHF模型前1小时腹腔注射PDTC100mg/kg,其余同模型组。2标本的采集和保存:分别于注药(D- GalN +LPS)后2,4,8,12,24小时行股静脉放血处死,各时间点取模型组6只,PDTC组6只大鼠。留取血清,放血处死后立即剖腹取肝脏,取适量肝组织经10%中性甲醛溶液固定,余经液氮速冻后置-80℃冰箱保存备用。3肝组织标本采用常规HE染色:光镜下观察肝脏病理学改变。4采用免疫组化S-P法,对肝组织标本进行NF-κB、TNF-α和iNOS的免疫组化染色。 5应用全自动生化分析仪检测血清丙氨酸氨基转移酶(alanine transarninase, ALT)和总胆红素(total bilirubin, TB)水平。6采用酶联免疫吸附试验( enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)方法检测血清中TNF-α的表达情况。7应用硝酸还原酶法检测血清中NO的变化。8用半定量反转录多聚酶链反应( reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)方法研究NF-κB、TNF-α和iNOS mRNA在两组肝组织中的表达情况。9统计学方法:所有数据采用SPSS 11.5软件进行统计学处理。计量资料均以x±S表示,计数资料均采用等级表示,采用秩和检验等统计学方法进行分析,以α=0.05为检验水准。结果: 1两组动物一般状况观察:模型组随着给药时间的延长,大鼠一般状况逐渐恶化,依次出现活动减少,饮水减少,毛发竖立,精神萎靡,嗜睡等。PDTC组各时间点大鼠与模型组相比情况有所好转,无嗜睡,昏迷等。 2两组肝组织形态学观察:⑴肝组织大体标本观察:模型组肝脏组织随时间延长出现充血、出血点、直至大块淤斑及坏死,肝组织边缘较钝。PDTC组各时间点肝组织病变程度较模型组轻。肝组织边缘较锐利,质地柔软,随时间延长仍有弥漫性出血点,但无大块淤斑及坏死。⑵肝组织HE染色:模型组随着给药时间延长,肝组织发生的病理改变逐渐加重,依次出现肝细胞水肿,炎细胞浸润,嗜酸性变,凋亡小体,直至大片出血,肝细胞坏死融合,核溶解、碎裂,纤维网状结构塌陷。PDTC组大鼠肝脏病理改变与模型组同一时间点相比,炎症坏死明显减轻,仍可见多量凋亡小体。 3血清ALT,TB,TNF-α和NO水平变化:模型组大鼠用药后2、4、8小时,ALT及TB水平缓慢升高,在12及24小时均急剧升高(P=0.000)。PDTC组与模型组相比均明显降低,ALT两组同时间点比较,除8小时外,其余各时间点均比模型组降低,差异有统计学意义(P0.05)。TB在4、12、24小时均比模型组降低,差异有统计学意义(P0.05)。模型组在用药后2小时,血清TNF-α明显升高,随着时间的延长,逐渐下降(χ2=27.871, P=0.000)。PDTC组各时间点与模型组相比,TNF-α的升高幅度明显降低,差异有显著统计学意义(P0.01)。模型组在用药后2小时起血清NO即出现明显升高,12h升高最明显,以后逐渐有所下降(χ2=24.062, P=0.000)。PDTC组2、8、12小时血清NO较模型组有明显下降,差异有显著统计学意义(P0.01)。 4两组肝组织NF-κB蛋白及mRNA表达变化NF-κB蛋白表达:模型组表达阳性细胞主要为肝细胞,随给药时间延长表达增加,12小时表达呈强阳性,随着肝细胞坏死的加重24小时阳性细胞数表达减少。PDTC组8、12小时NF-κB蛋白表达与模型组同一时间点比较,明显减少,差异具有统计学意义(P0.05)。 NF-κBmRNA表达:模型组NF-κBmRNA随给药时间延长表达增加,8小时达高峰,以后逐渐下降(χ2=26.307,P=0.000)。PDTC组4、8小时NF-κBmRNA表达与模型组同一时间点比较,明显减少,差异具有统计学意义(P0.05)。 5两组肝组织TNF-α蛋白及mRNA表达变化 TNF-α蛋白表达:模型组表达阳性细胞主要为肝细胞。随给药时间延长肝细胞胞浆阳性表达的细胞数逐渐增多, 12小时表达呈强阳性,24小时表达减少(χ2=19.361,P=0.000)。PDTC组4、8、12小时TNF-α蛋白表达与模型组同一时间点比较,明显减少,差异具有统计学意义(P0.05)。 TNF-αmRNA表达:模型组TNF-αmRNA随给药时间延长表达增加,12小时升高最明显,24小时有所下降(χ2=25.385, P=0.000)。PDTC组8、12、24小时TNF-αmRNA表达与模型组同一时间点比较,明显减少,差异具有统计学意义(P0.05)。 6两组肝组织iNOS蛋白及mRNA表达变化iNOS蛋白表达:模型组表达阳性细胞主要为肝细胞,随给药时间延长肝细胞胞浆阳性表达的细胞数逐渐增多,8小时呈强阳性表达,12小时及24小时阳性表达的细胞数有所下降,差异具有显著统计学意义(χ2=22.895,P=0.000)。PDTC组4、8小时iNOS蛋白表达与模型组同一时间点比较,明显减少,差异具有统计学意义(P0.05)。 iNOSmRNA表达:模型组iNOSmRNA随给药时间延长表达增加,8小时升高最明显,12小时及24小时逐渐下降,差异具有显著统计学意义(χ2=25.281,P=0.000)。PDTC组iNOSmRNA表达4小时及8小时与模型组同一时间点比较,明显减少,差异具有统计学意义(P0.05)。模型组及PDTC组iNOS mRNA的表达与NF-κB mRNA呈正相关,相关系数分别为0.978和0.940,P值分别为0.004和0.017。结论: 1 TNF-α、iNOS、NO在D-GalN+LPS诱导的大鼠暴发性肝衰竭肝细胞的炎症坏死中发挥了重要的作用。 2 NF-κB与iNOS、TNF-α密切相关,证实了NF-κB在暴发性肝衰竭肝细胞炎症坏死中起关键作用。 3 PDTC抑制了D-GalN+LPS导致的实验性暴发性肝衰竭中NF-κB的活化。 4 PDTC能够通过抑制NF-κB的表达明显减轻D-GalN+LPS导致的大鼠暴发性肝衰竭肝细胞的炎症坏死。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R575.3

【参考文献】