内毒素对大鼠原代肝星状细胞TGF-β1表达的影响及其机制的初步研究

发布时间：2020-06-01 17:53

【摘要】： [目的]探讨一种经济易行的大鼠肝星状细胞的分离与培养方法,为今后从细胞及分子水平上研究肝纤维化的发病机理提供有利条件。 [方法]取成年大鼠,用两步酶液对其肝脏进行离体循环灌注,经两种密度的Nycodenze密度梯度高速离心(20000r／min)和细胞悬液低速离心(40×g)去杂质后得到原代HSCs。台盼兰拒染实验鉴定细胞活率,des min和GFAP免疫细胞化学双抗单染色法鉴定刚分离的肝星状细胞的纯度。(?)-SMA免疫细胞化学AEC显色鉴定培养7天的细胞活化程度。 [结果]HSCs的得率为(3.6±0.1)×107／肝,HSCs存活率为(92.8±0.8)%,对培养24小时的HSCs行des min和GFAP共同鉴定DAB显色,细胞阳性率为(96.2±0.5)%；取培养7天的细胞爬片做(?)-SMA做HSCs的活化鉴定AEC显色,细胞阳性率为(72.3±0.6)%。 [结论]改良法在保障大鼠原代HSCs产量的前提下提高了细胞纯度,有利于对原代大鼠HSCs生物学特性及肝纤维化机制的进一步研究。 [目的]观察内毒素刺激大鼠原代HSCs后TGF-β1表达的影响,探讨PDTC(NF-κB抑制剂)改善肝纤维化的机制。 [方法]用链酶蛋白酶液和胶原酶液离体灌注消化健康成年大鼠肝脏,Nycodenze密度梯度离心,得到原代HSCs,在含有内毒素终浓度分别为0.01、0.1、1、10μg／ml的培养液中培养,各浓度组分别在培养第2、4、8天时收集细胞培养上清液,-20℃保存,Elisa法测定TGF-β1含量。在含有各浓度内毒素的培养液中分别在第2、4、8天换成含PDTC终浓度为10pmol／L且含有原浓度内毒素的培养液,对照组在第2、4、8天时换成只含有原浓度内毒素未加PDTC的培养液,48小时后,收集细胞培养上清液-20℃保存,Elisa法测定TGF-β1含量。 [结果]内毒素直接刺激HSCs,分别在第2、4、8天测得的TGF-β1含量均高于对照组,且1μg／ml组TGF-β1的表达升高最多,其次为0.1μg／ml组,10μg／ml组和0.01μg／ml组。加入PDTC后,各组TGF-β1的表达量均低于对照组。 [结论]一定浓度的内毒素直接作用原代HSCs使其TGF-β1表达增加,提示内毒素可直接引起HSCs的活化,这可能是内毒素促进肝纤维化的途径之一。PDTC直接作用于HSCs可使TGF-β1表达降低提示我们PDTC可能是通过抑制核因子κB降低TGF-β1的表达来改善肝纤维化的,核因子κB可能是其靶点之一。
【图文】：

结果1狱咒污整个自然活化过程的形态学观察在倒置显微镜下，刚分离出的月百O边界清楚，，细胞呈圆形，透亮，折光性强数小时后看见细胞部分贴壁，24小时后细胞体积稍许增大，折光性较前减弱，48看见细胞开始伸出伪足，有的呈梭形，有的呈蛾蚌状。7天后细胞变长，胞体较大，型的活化细胞样。培养14天后，细胞全部活化(见图1，2)。2月国C，的产量、活度及性质鉴定本方法采用两步酶消化法，用两种不同浓度的抑‘口denze得到未活化的月谷。，只大鼠体重3009，产量达(3.6士0.1)x107/肝，0.4%台盼兰拒然实验鉴定活细胞率为士0.8)%，取培养24小时的细胞爬片进行de:min和GF通尸〔，’一l2]共同鉴定DAB染色，胞率为(%.2士0.5)%(见图3，);取培养7天的细胞爬片做a一SMA做HSCS的活化鉴显色，取培养7天的细胞爬片做a一S撇做HSCs的活化鉴定AEC显色，细胞阳性率为士0.6)%(见图4，5)图1:刚分离的月污食(x250)o
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R575.2

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本文编号：2691850