粪便移植和益生菌干预对葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠结肠炎发生和发展的影响

发布时间：2020-06-02 05:45

【摘要】：目的建立葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠结肠炎模型,用粪便移植(FMT)和乳酸菌作为干预手段对模型进行干预,评价肠道菌群调节的两种干预方法对DSS诱导的小鼠结肠炎发生、发展的影响及其相关机制。方法1.分别对6-8周的C57BL/6N、C57BL/6J、BALB/c雌性小鼠给予含有3%或5%的DSS的无菌水自由饮用6天以诱导急性结肠炎。每日监测小鼠的体重,粪便形态以及粪便潜血,综合分析疾病活动指数(DAI),以确定造模敏感稳定的小鼠品系进行后续干预评价研究。2.对小鼠给予DSS造模同时进行粪便移植干预处理,粪便取自正常同型小鼠,在厌氧条件下培养2-3 h后,取粪便上清液200 μL/只/天对小鼠进行灌胃,连续5天。3.对小鼠给予含5×108 CFU/mLHT121-2乳酸杆菌的饮用水提前干预1周后,给予3%DSS饮水造模同时每天给小鼠5×108 CFU/只/天灌胃处理,连续5天。4.利用荧光定量PCR检测小鼠肠组织多种基因mRNA的表达。利用流式细胞术检测分析产生IL-17A和IL-22的淋巴细胞在肠粘膜的分布以及主要细胞来源。结果:1.DSS诱导急性结肠炎模型建立:(1)三个品系小鼠的DSS结肠炎模型组与各自对照组相比体重均呈现不同程度下降,C57BL/6J小鼠模型组体重降低最早、最显著。第6天实验结束时C57BL/6J、C57BL/6和NBALB/c的体重下降率分别为(21.79±2.58)%,(12.52±3.97)%和(2.88±4.76)%。(2)C57BL/6J小鼠模型组粪便评分从第3天开始显著升高;C57BL/6N和BALB/c小鼠模型组的粪便形态评分与对照组均无显著差异。(3)C57BL/6J小鼠模型组的便潜血评分和DAI评分与Control组从第1天起有显著差异;C57BL/6N和BALB/c组的差异出现较晚。(5)C57BL/6J和BALB/c小鼠模型组与Control组的结肠长度有统计学差异,而C57BL/6N组无统计学差异。综上分析确认C57BL/6J小鼠对DSS诱导的急性结肠炎最为敏感。2.粪便移植(FMT)干预评价:FMT能有效干预DSS结肠炎引起的小鼠体重下降,在实验第6天FMT+DSS组平均体重(15.60±0.87)g显著高于PBS+DSS组的平均体重(14.42±0.99g,P0.0])。FMT+DSS组粪便形态评分在第5天显著低于PBS+DSS组(P0.01),便潜血评分在第2—4天均显著低于PBS+DSS组(P0.01);FMT+DSS组的DAI评分从第2天开始显著低于PBS+DSS组。FMT组第6天的平均结肠长度显著高于PBS+DSS组(4.90±0.39 vs 4.41±0.41 cm,P0.01);与PBS+DSS组相比,FMT+DSS组的结肠炎症病理学变化较轻。结肠组织的mRNA基因表达研究发现DSS可诱导多种基因不同程度地表达,但FMT干预主要引起Claudin2基因的表达上调,与PBS+DSS组有显著统计学差异(0.75±0.32 vs 0.36±0.20,P0.05)。该结果表明FMT干预有效减轻了 DSS诱导结肠炎的发生发展的临床症状、结肠的大体和病理病变,并且引起了宿主结肠组织的基因表达变化,提示Claudin2基因的上调表达可能参与FMT影响DSS诱导小鼠结肠炎发生发展的干预机制。3.乳酸杆菌HT121-2干预评价:乳酸杆菌干预组粪便形态评分和DAI在第3、4天显著低于模型组(P0.05),粪便潜血评分和体重减轻率没有统计学差异。乳酸杆菌干预组第6天的平均结肠长度显著高于PBS+DSS组(4.7±0.35 vs 4.38±0.40cm,P0.05);与PBS+DSS组相比,乳酸杆菌干预组的结肠炎症病理学变化较轻,病理分级评分有统计学差异。结肠组织的mRNA基因表达研究发现乳酸杆菌干预可引起结肠组织中抗微生物肽Reg3γ的明显表达上调,与PBS+DSS 组有显著统计学差异(156.24±49.46vs89.25±46.20)(P0.05)。该结果表明乳酸杆菌干预能够一定程度减轻DSS诱导结肠炎的发生发展的临床症状、结肠的大体和病理病变,还引起了宿主结肠组织的Reg3γ基因表达的显著变化,提示Reg3γ基因可能参与了乳酸杆菌保护DSS诱导小鼠结肠炎发生发展。4.DSS诱导C57BL/6J小鼠急性结肠炎中3型天然淋巴细胞的分布与功能研究初探:结果显示DSS处理导致小鼠肠道上皮内淋巴细胞所占比例下降,固有层淋巴细胞发生明显聚集。正常对照组和DSS模型组小鼠肠道固有层能分泌IL-22和IL-17A的Lineage+ CD4+淋巴细胞比例均小于1%,即DSS诱导的早期急性结肠炎中固有层Lineage+ CD4+淋巴细胞不是产生IL-17A和IL-22的主要细胞来源。研究发现产生IL-22和IL-17A的细胞在Lineage-CD127+淋巴细胞中的比例分别是43.34%和18.04%,即肠道固有层Lineage-CD127+淋巴细胞是DSS诱导的小鼠早期急性结肠炎中IL-22和IL-17A的主要来源细胞之一。结论 1.对比 C57BL/6J、C57BL/6N 和 BALB/c 小鼠,确认了 C57BL/6J 对 DSS诱导急性结肠炎最为敏感。2.FMT干预和乳酸杆菌HT121-2干预对DSS诱导的C57BL/6J小鼠急性结肠炎都有保护作用。DSS诱导宿主肠道组织IL-17A,IL-22,Claudin2,TNF-α等多种基因的表达变化,但FMT和乳酸杆菌干预引起宿主肠组织基因表达不同,提示两种干预的机制可能不同。3.DSS诱导急性结肠炎早期产生IL-17A和IL-22的主要细胞来源是肠道固有层Lineage-CD127+淋巴细胞。
【图文】：

趋势图,结肠,小鼠,长度变化

两组之间平均结肠长度无统计学差异（Ｚ＾Ｏ．０５）；邋ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠的ＤＳＳ组逡逑实验第６天结肠长度为（６．０８±０．４８），邋Ｃｏｎｔｒｏｌ组的实验第６天结肠长度为逡逑（７．００±０．２６）邋ｃｍ，两组之间结肠长度有统计学差异（Ｐ＜０．０５）（如图１－２）。根据逡逑结肠长度指标可知

趋势图,粪便,小鼠,结肠

组便潜血评在实验的第２－４天明显低于ＰＢＳ＋ＤＳＳ组（Ｐ＜０．０５或Ｐ＜０．０１）；逡逑ＦＭＴ＋ＤＳＳ组ＤＡＩ评分从第２天开始明显低于ＦＭＴ＋ＤＳＳ组（／＾Ｏ．Ｏ〗或Ｐ＜０．０１）逡逑（如图２－１邋）。总之ＦＭＴ能显著保护ＤＳＳ诱导的小鼠结肠炎模型体重变化，潜血逡逑评分和ＤＡＩ评分。逡逑１；：＾＾逦！：逦Ｚ７逡逑”逦．逦．逦Ｗ逦＾逦？逦ｊ逦１—逡逑，＾邋＾邋，邋……逡逑Ｔｍｅ邋（ｄ）逦Ｔｉｍｅ邋（ｄ）逡逑＋邋ＰＢＳ＋ＤＳＳ逦＾逦？邋ＰＢＳ＋ＤＳＳ逡逑？邋４－逦＊？逦逦逦？逦ＦＭＴ＋ＤＳＳ逦４－逦＊＊逦Ｆ＾ＴＴ－ｆＤＳＳ逡逑Ｕ逦丨逡逑0邋N——？邋．邋．邋ｒ—逦0＜逦，邋，邋，邋ｒ—逡逑＾邋ｋ邋？ｖ邋＾逦＼逦＾邋Ｖ邋？＞逡逑Ｔｉｍｅ邋（ｄ）逦Ｔｉｍｅ逡逑图２－１：邋ＦＭＴ＋ＤＳＳ组和ＰＢＳ＋ＤＳＳ组小鼠每天的体重，粪便形态评分，粪便潜血评分及ＤＡＩ逡逑评分的变化趋势（ＰｃＯ．ＯＳ）逡逑２．４．３结肠长度逡逑Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠的ＤＳＳ结肠炎模型中结肠长度是一个敏感的指标，ＦＭＴ＋ＤＳＳ逡逑组的结肠长度在实验第６天是（４．９０±０．３９）邋ｃｍ，明显长于ＰＢＳ＋ＤＳＳ组实验第６逡逑天结肠长度（４．４１±０．４１）邋ｃｍ
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R574.62

【参考文献】