顽固性功能性便秘和特发性巨结肠患者结肠粘膜菌群和粘膜屏障的研究

发布时间：2020-06-03 00:28

【摘要】：顽固性功能性便秘是一种常见的结肠功能障碍性疾病,因其程度重,药物治疗效果不佳,严重影响患者的生活质量,最终多需要外科治疗。根据结肠的直径,便秘可分为两种类型:结肠直径正常型和巨结肠型。特发性巨结肠是巨结肠型便秘的一种,表现为顽固性便秘。顽固性便秘和特发性巨结肠的发病机制尚不清楚。肠道菌群是人体主要微生物群落,肠腔内细菌种类多,数量大,是肠屏障的重要组成部分。肠道菌群参与机体的营养代谢,免疫调节,上皮基因的表达的调控,屏蔽致病菌等多种生理过程。近年来,一些非培养的分子生物学方法,如变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE),克隆文库,DNA微矩等,被用于研究疾病状态下的肠道菌群变化,如抗生素相关性肠炎、炎症性肠病、肠易激综合征等。基于肠道菌群在便秘和特发性巨结肠的发生和发展过程中可能发挥着重要作用,有必要使用分子生物学和生态学方法来加深对便秘和特发性巨结肠患者结肠菌群改变的认识。便秘(包括特发性巨结肠)状态下,结肠内容物停留时间延长,结肠菌群改变,这些都对结肠屏障功能提出了更为严峻的考验。结肠粘膜紧密连接和结肠粘液屏障对于维持结肠屏障功能极为重要。对于便秘和特发性巨结肠患者结肠粘膜紧密连接和粘液屏障的研究可以加深我们对于便秘和特发性巨结肠的认识。本研究中,我们使用DGGE检测顽固性功能性便秘和特发性巨结肠患者结肠粘膜菌群改变特征,找出显著改变的细菌。同时,我们观察结肠粘膜上皮紧密连接和杯状细胞改变特征,对于顽固性功能性便秘和特发性巨结肠的基本病理生理有更深刻的认识,为今后临床实践提供一定的理论依据。第一部分顽固性功能性便秘和特发性巨结肠患者结肠粘膜菌群改变特征研究一顽固性功能性便秘患者结肠粘膜菌群改变特征目的:研究顽固性功能性便秘患者结肠粘膜菌群的改变特征,并找出有特征性变化的菌株。病人和方法:实验分为两组:顽固性功能性便秘组(便秘组)16人;对照组9人。在术中获取病人乙状结肠粘膜标本,提取DNA,扩增后进行变性梯度凝胶电泳(DGGE),观察菌群结构变化,使用Quantity One软件分析DGGE条带,对菌群的结构进行相似性,多样性和主成分分析(PCA)分析,对有显著变化的条带割胶测序,并使用NCBI的BLAST工具与Nucleotide collection(nr/nt)数据库内基因比对,鉴定其细菌种属。结果:便秘患者结肠粘膜菌群与对照组有明显差异。便秘组结肠粘膜菌群优势菌群条带数明显低于对照组(18.38±5.20vs28.22±5.24P0.01),便秘组患者结肠粘膜菌群香农多样性指数明显少于对照组(P=0.01),提示顽固性功能性便秘患者结肠粘膜菌群多样性减少。顽固性功能性便秘肠粘膜菌群的特征性改变表现为:3种拟杆菌菌门细菌和2种硬壁菌菌门细菌相对丰度减少,同时伴有2种未曾培养过的细菌相对丰度的明显增加(P0.05)。结论:顽固性功能性便秘患者结肠粘膜存在菌群紊乱,表现为:菌群多样性减少,拟杆菌菌门和硬壁菌菌门细菌相对丰度减少,同时伴有两种未曾培养过的细菌相对丰度的明显增加。研究二特发性巨结肠患者结肠粘膜菌群改变特征目的:研究特发性巨结肠患者结肠粘膜菌群的改变特征,并找出有特征性变化的菌株。病人和方法:实验分为两组:特发性巨结肠组(巨结肠组)10人;对照组11人。在术中获取病人乙状结肠粘膜标本,提取DNA,扩增后进行变性梯度凝胶电泳,观察菌群的结构变化,对菌群结构进行相似性,多样性和主成分分析分析,对有显著变化的条带割胶测序,鉴定其细菌种属。结果:巨结肠组患者结肠粘膜菌群与对照组有明显差异。巨结肠组患者结肠粘膜菌群条带数明显多于对照组(P0.01),巨结肠组患者结肠粘膜菌群香农多样性指数明显增多(P0.01),提示巨结肠组结肠粘膜菌群多样性增多。巨结肠组粘膜菌群的特征性变化菌群是:5种拟杆菌菌门细菌相对丰度明显升高伴有1种拟杆菌菌门细菌相对丰度明显降低。结论:特发性巨结肠患者结肠粘膜存在菌群紊乱,其特征性表现为:菌群多样性增多,5种拟杆菌菌门细菌的相对丰度增加伴1种拟杆菌菌门细菌相对丰度明显降低。第二部分顽固性功能性便秘和特发性巨结肠患者结肠粘膜紧密连接和杯状细胞的研究研究一顽固性功能性便秘和特发性巨结肠患者结肠粘膜紧密连接的研究目的:研究顽固性功能性便秘和特发性巨结肠患者结肠粘膜紧密连接的微观结构和紧密连接蛋白Occludin和Claudin-1的变化特征。病人和方法:病人分为三组,顽固性功能性便秘组(便秘组)、特发性巨结肠组(巨结肠组)和对照组各8人。在术中获取病人乙状结肠标本,进行:普通病理染色观察结肠上皮微绒毛的变化;电镜观察紧密连接的超微结构的变化;蛋白印迹对肠粘膜紧密连接蛋白Occludin和Claudin-1进行半定量分析;免疫荧光检测对Occludin和Claudin-1进行原位分析。结果:便秘组和巨结肠组病人结肠粘膜上皮微绒毛光镜下无明显损伤。便秘组、巨结肠组和对照组结肠粘膜紧密连接结构均完整,紧密连接蛋白Occludin和Claudin-1表达量无明显差异、免疫荧光表达在位。结论:顽固性功能性便秘和特发性巨结肠患者结肠粘膜紧密连接结构完整,紧密连接蛋白Occludin和Claudin-1表达与对照组无差异。研究二顽固性功能性便秘和特发性巨结肠患者结肠粘膜杯状细胞的研究目的:研究顽固性功能性便秘和特发性巨结肠患者结肠粘膜杯状细胞的变化。病人和方法:病人分为三组:顽固性功能性便秘组(便秘组)、特发性巨结肠组(巨结肠组)和对照组各8人。在术中获取病人乙状结肠标本,进行:HE染色了解结肠微绒毛形态,对杯状细胞进行计数;西弗氏/阿利辛兰(AB/PAS)染色,对杯状细胞粘液进行特殊染色,进一步对杯状细胞进行分析。结果:HE染色和AB/PAS染色均可以看到:便秘组和巨结肠组患者乙状结肠微绒毛较对照组变细,单位面积内杯状细胞增多(p0.01),巨结肠组患者乙状结肠绒毛较便秘组更细,杯状细胞数更多(p0.01)。结论:在顽固性功能性便秘和特发性巨结肠状态下,结肠微绒毛变细,单位面积内杯状细胞相对增多,特发性巨结肠较顽固性功能性便秘变化更明显。
【图文】：

ＤＧＧＥ指纹图谱逡逑ＤＧＧＥ图中，每个纵向泳道代表一个样品的菌群结构，每个泳道里的一代表一种细菌，条带的强度代表该细菌的数量。在水平方向位于同一位置认为是同一种细菌。如图２所示，Ａ１到Ａ９为对照组，，Ｂ１到Ｂ１６为便秘代表一个病人的结肠粘膜菌群结构，Ｃ５、Ｃ６分别代表一种细菌，Ｃ１４的显高于Ｃ９，那么说明Ｃ１４对应的细菌量明显多于Ｃ９，邋Ｃ１４和Ｒ１２在同一，认为Ｃ１４和Ｒ１２是同一种细菌。逡逑．３．２相似性分析逡逑

图２顽固性功能性便秘和对照组患者结肠粘膜标本的ＤＧＧＥ条带。Ａ代表对照逡逑组患者（Ａ１－Ａ９）邋，邋Ｂ代表顽固性功能性便秘患者（Ｂ１－Ｂ１６）。逡逑相似性分析显示：所有的条带主要分为两大组，第一组中有８条条带，其中逡逑有６条是对照组的条带；第二组中有１６条条带，其中１３条条带是顽固性功能性便逡逑秘组的条带。由此可以看出，顽固性功能性便秘组患者结肠粘膜菌群和对照组病逡逑人粘膜菌群有明显差异。顽固性功能性便秘患者和对照组病人结肠粘膜菌群的逡逑ＤＧＧＥ指纹图谱显示：与对照组病人结肠粘膜菌群结构相比，顽固性功能性便秘逡逑患者菌群多样性降低，一些条带相对丰度明显增高。逡逑
【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R574.62

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本文编号：2694002