白细胞介素-21在乙型肝炎相关慢加急性肝衰竭发病机理中的作用

发布时间：2020-06-04 06:28

【摘要】：研究背景与目的慢加急性肝衰竭(ACLF)是指在既往明确诊断或未诊断的慢性肝病基础上,出现急性肝功能损害,表现为黄疸和凝血功能障碍,并且在4周内出现腹水或/和肝性脑病。在我国,90%以上ACLF病例存在HBV感染,被称为乙型肝炎相关慢加急性肝衰竭(HB-ACLF)。 HB-ACLF患者病情重,治疗费用高,预后不良,3个月生存率只有62%,目前唯一有效的治疗手段是肝移植。目前认为HB-ACLF的发病取决于病毒和宿主两方面因素。一方面研究认为,HBV基因组前C区(PC)和C基因启动子(BCP)核苷酸变异可能引起病毒复制和抗原表达水平的改变,可能与乙型肝炎相关肝衰竭的发生有关。另一方面,更多的研究集中在HB-ACLF发病时机体免疫状况的改变,结果发现单核-巨噬细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞、CD4+及CD8+T淋巴细胞、调节性T细胞、Th17细胞以及多种细胞因子都可能参与HB-ACLF发生和发展过程。白细胞介素-21(IL-21)是由激活的CD4+T细胞和NKT细胞分泌的一种Ⅰ类细胞因子,广泛参与机体免疫活动的调控作用,能够影响多种免疫细胞的发育、活化、扩增和功能表达。研究发现IL-21与炎性肠病、系统性红斑狼疮、Ⅰ型糖尿病、银屑病和风湿性关节炎等多种炎症性、自身免疫性或风湿性疾病发病有关。而且越来越多的证据表明,IL-21参与机体的抗感染免疫,如人类免疫缺陷病毒感染时,IL-21能够促进NK和CD8+T细胞存活、增强其细胞毒活性。最近,来自HBV转基因鼠的研究发现,IL-21的分泌具有年龄依赖性；然而,IL-21在HBV感染导致的肝脏炎症活动,肝细胞损伤和病毒控制中的作用至今未明。本研究通过检测HB-ACLF、重度和轻度慢性乙型肝炎(S-CHB和M-CHB)患者以及健康对照(HC)血清IL-21及相关细胞因子水平,IL-21分泌细胞及相关CD4+T细胞亚群的频数,以及IL-21对其它炎症因子分泌的影响,探索IL-21在HB-ACLF发病中的作用,并分析及其与疾病严重程度和预后的关系。研究方法第一部分：血清IL-21及相关细胞因子的检测本部分纳入39例HB-ACLF、20例S-CHB、20例M-CHB患者和10例HC。HB-ACLF和S-CHB为2008年1月至2009年7月在南方医院感染内科和广州市第八人民医院住院患者。随访至2010年6月,HB-ACLF患者22例存活,16例死亡,1例接受原位肝移植；S-CHB患者全部存活。对其中7例入院后病情逐渐缓解的HB-ACLF患者进行动态观察,这些患者入院只接受常规内科对症治疗和核苷(酸)类似物(拉米夫定或恩替卡韦)抗HBV治疗,均未接受糖皮质激素和血浆置换术。 HB-ACLF的纳入标准为：(1)血清HBsAg阳性时间大于12个月；和(2)血清总胆红素(TBIL)17、或每天上升17.1μmol/L;和(3)凝血酶原活动度(PTA)40%；和(4)起病(出现黄疸和凝血功能障碍)后4周内出现腹水或／和肝性脑病。 S-CHB的纳入标准为：(1)血清HBsAg阳性时间大于12个月；和(2)血清谷丙转氨酶(ALT)600U/L;和(3)血清TBIL51.3μmol/L;和(4)PTA60%;但不足以诊断为HB-ACLF的患者。 M-CHB患者均为上述时间段南方医院门诊患者,纳入标准：(1)血清HBsAg阳性时间大于12个月；和(2)血清ALT400U/L且80U/L:和(3)血清TBIL 51-3μmol/L。健康对照10例,均为南方医院感染内科实验室学生或工作人员,纳入标准：(1)血清HBsAg阴性；和(2)血清ALT40U/L;和(3)血清TBIL17.1μmol/L。所有研究对象均排除以下情况：(1)年龄60岁或18岁；或(2)合并感染人类免疫缺陷病毒(HIV)、甲型肝炎病毒(HAV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)或戊型肝炎病毒(HEV)；或(3)合并甲状腺功能亢进、糖尿病等自身免疫性疾病；或(4)合并恶性肿瘤；或(5)半年内接受过干扰素、糖皮质激素、或其它免疫调节制剂；或(6)影像学或组织学发现明显肝硬化。分离所有研究对象的血清-80℃贮存,采用流式微球试验(CBA)批量检测血清中包括IL-21在内的12种细胞因子的水平。第二部分：外周IL-21分泌细胞的检测本部分纳入21例HB-ACLF(存活14例,未存活7例)、13例S-CHB.19例M-CHB患者和10例HC,并对6例HB-ACLF恢复患者进行动态观察。有8例S-CHB为新增病例,为同期南方医院或广州市第八人民医院的住院患者；其余病例均来自第一部分试验。纳入和排除标准如上述。密度梯度离心法分离患者外周血单个核细胞(PBMC),采用细胞内因子染色(ICS)的方法经流式细胞仪检测外周IL-21分泌细胞及相关CD4+T细胞亚群的频数。第三部分：IL-21对PBMC分泌其它细胞因子的影响选择9例CHB患者和6例HC进行IL-21的体外诱导实验。CHB的诊断标准参考2010年新版《慢性乙型肝炎防治指南》。分离研究对象的PBMC,以不同浓度(0、10和100ng/mL)的重组人IL-21(rhIL-21)蛋白刺激培养24小时后,收集培养上清,采用Bender FlowCytomix系统检测11种细胞因子的浓度。研究结果第一部分：HB-ACLF患者血清II-21及相关细胞因子水平的变化。不同人群血清IL-21及相关细胞因子浓度的比较。血清IL-21水平在HC. M-CHB. S-CHB和HB-ACLF依次升高,HB-ACLF患者显著高于其它三组人群(P0.001,P0.001和P=0.001),且S-CHB患者显著高于HC(P=0.042)。血清IL-6、IL-8、IL-10、IL-17A、IFN-γ和TNF-a水平在HB-ACLF亦有所升高,而IL-12/IL-23p40低于M-CHB,IL-1p、IL-2、IL-4和IL-12p70在四组人群间无显著差异。 HB-ACLF存活与未存活患者血清IL-21及相关细胞因子的比较。未存活组血清IL-21(P=0.024)与IL-2(P=0.021)、IL-6(P=0.028)和IL-10(P=0.008)浓度显著高于存活组患者。IL-12p70和IL-17A略高于存活组患者,但无统计学差异(P=0.106和P=0.130)。其它细胞因子两组间比较均无显著差异。 HB-ACLF恢复患者血清IL-21及相关细胞因子的动态变化。随着病情缓解,血清IL-21(P=0.003)与IL-1β (P=0.050)、IL-8(P=0.004)、IL-12p70(P=0.018).和IFN-γ(P=0.015)水平均逐渐下降,前后比较有统计学差异；而IL-12/IL-23p40则逐渐升高,尽管统计学差异不显著(P=0.104)。血清IL-21及相关细胞因子水平与疾病严重程度的相关性。血清IL-21水平与MELD积分(r=0.573, P0.001)、TBIL (r=0.566, P0.001)、 PTA (r=-0.520, P0.001)、白蛋白(ALB, r=-0.369, P=0.001)、肌酐值(CR, r=0.327, P=0.012)显著相关,而与HBV DNA和谷丙转氨酶(ALT)无显著相关性。其它细胞因子,与TBIL显著相关的有IL-6、IL-8、IL-12p70、IL-17A、IL-12/12-23p40和IFN-γ;与MELD积分、PTA和ALB显著相关的有IL-6、IL-8和IL-17A,与CR显著相关的有IL-4、IL-10和IFN-γ。血清细胞因子对HB-ACLF临床结局的预测价值。以HB-ACLF患者两种不同临床结局(存活或未存活)为因变量,以12种细胞因子浓度为协变量进行Logistic回归分析,构建诊断模型。有6种细胞因子进入回归方程,其中IL-21. IL-2、IL-10和TNF-α为HB-ACLF死亡患者的危险因素,而IL-17A和IL-12/IL-23p40为保护因素。该模型对HB-ACLF患者临床结局的正确判断率为84.6%(33/39),低于MELD积分的正确判断率97.4%(38/39)。进一步对每种细胞因子构建受试者工作特征曲线(ROC),并计算曲线下面积(A),只有IL-21(A=0.695,P=0.039)与IL-2(A=0.718,P=0.021)、IL-6(A=0.707,P=0.028)和IL-10(A=0.749, P=0.008)的诊断意义具有显著性(P0.05),但其诊断效能仍低于MELD积分(A=0.953,P0.001)。第二部分：HB-ACLF患者外周IL-21分泌细胞及相关CD4+T细胞亚群的频数变化。不同人群IL-21分泌细胞及CD4+T细胞亚群的频数比较。四组人群分泌IL-21、IFN-γ、IL-10或IL-17A的总CD4+T细胞频数整体比较均有显著差异,IL-21+CD4+T细胞在HB-ACLF组最高,IFN-y+CD4+T细胞频数在M-CHB组最高,而IL-10+CD4+T细胞和IL-17A+CD4+T细胞颇数存S-CHB织最高。名重比较发现：HB-ACLF和S-CHB患者的IL-21+CD4+T细胞频数均显著高于M-CHB患者(P0.001和P=0.002)和HC(P0.001和P=0.001),而HB-ACLF与S-CHB患者之间无显著差异。M-CHB患者IFN-γ+CD4+T细胞频数显著高于S-CHB(P0.001)和HB-ACLF (P=0.004)患者,而与HC比较差异无显著性。S-CHB和HB-ACLF患者IL-10+CD4+T细胞频数显著高于M-CHB患者(均P0.001)和HC(P=0.001和P=0.002),且S-CHB患者显著高于HB-ACLF患者(P=0.028)。三组HBV感染患者之间的IL-17A+CD4+T细胞频数相互比较无显著差异,但均显著高于HC (HB-ACLF, P=0.003; S-CHB, P=0.004; M-CHB, P=0.017)。进一步对IL-21+CD4+T细胞共表达IFN-γ、IL-10和IL-17A的情况进行分析发现：EL-21+IFN-γ+、IL-21+IL-17A+、IL-21+IL-10+和IL-21+IFN-γ-IL-10IL-17A-的CD4+T细胞亚群在四组人群间整体比较均有显著差异。除IL-21+IL-10+CD4+T细胞亚群的频数在S-CHB最高外,另外三个IL21+CD4+T细胞亚群的频数均以HB-ACLF患者最高。四组人群之间多重比较：HB-ACLF和S-CHB患者的IL-21+IFN-γ-IL-10IL-17A-CD4+T细胞亚群频数显著高于M-CHB患者(均P0.001)和HC(P0.001和P=0.001),而S-CHB与HB-ACLF无显著差异。IL-21+IFN-γ+CD4+T细胞亚群频数在HC、M-CHB、S-CHB和HB-ACLF患者递增,HC显著低于三组HBV感染患者(P=0.018,P=0.006和P0.001),且M-CHB患者显著低于HB-ACLF患者(P=0.021),而S-CHB与HB-ACLF患者比较无显著差异。S-CHB和HB-ACLF患者的IL-21+IL-10+CD4+T细胞亚群频数显著高于M-CHB患者(P0.001和P=0.001)和HC(P0.001和P=0.002),且S-CHB高于HB-ACLF患者(P=0.030)。HB-ACLF患者的IL-21+IL-17A+CD4+T细胞亚群频数显著高于M-CHB患者(P=0.004)和HC (P0.001), S-CHB患者亦高于HC(P=0.012),而其余各组间比较无差异。 HB-ACLF存活与未存活患者IL-21分泌细胞及CD4+T细胞亚群的比较。入院时存活与死亡患者外周分泌IL-21. IFN-γ. IL-10或IL-17A的CD4+T细胞频数均无显著差异。进一步分析IL-21与IFN-γ、IL-10和IL-17A共表达的CD4+T细胞频数在两组间亦无显著差异。 HB-ACLF恢复患者外周IL-21分泌细胞及CD4+T细胞亚群的动态变化。6例恢复期HB-ACLF患者外周IL-21+CD4+T细胞频数随病情缓解而逐渐下降,前后变化具有显著意义(P0.001)；而分泌IFN-γ、IL-10或IL-17A的CD4+T细胞亚群频数在病程中的变化无统计学差异。进一步对IL-21与IFN-γ、IL-10或IL-17A共表达CD4+T细胞亚群频数的动态变化进行分析,发现IL-21+IL-10+(P=0.007)和IL-21+IFN-γ-IL-10-IL-17A-(P0.001) CD4+T细胞频数前后比较具有统计学差异,均随疾病恢复而下降；余无显著差异。外周IL-21分泌细胞及CD4+T细胞亚群与疾病严重程度的相关性。对进行ICS检测的53例处于不同疾病状态(HB-ACLF. S-CHB或M-CHB)的HBV感染者的外周IL-21分泌细胞及CD4+T细胞亚群的频数与反映疾病严重程度的临床参数进行相关性分析。IL-21CD4+T细胞频数与MELD积分(r=0.605,P0.001)、TBIL (r=0.656, P0.001)、PTA (r=-0.322, P=0.019)和ALB (r=-0.587, P0.001)均显著相关,而与HBVDNA、ALT和CR的无显著相关性。IFN-y+CD4+T细胞频数与ALT、TBIL和MELD积分呈负相关,而与ALB、CR和PTA呈正相关。IL-10+CD4+T细胞频数与TBIL和MELD积分呈正相关,而与ALB呈负相关。IL-17A+CD4+T细胞频数与各临床指标均无显著相关性。对IL-21与IFN-γ、IL-10和IL-17A的共表达CD4+T细胞与疾病严重程度的相关性进行分析发现：在排除上述三种共表达细胞的干扰后,IL-21+IFN-γ-IL-10-IL-17A-CD4+T细胞频数与TBIL (r=0.733, P0.001)、MELD积分(1-0.649, P0.001)、ALB (r=-0.674, P0.001)和PTA (r=-0.377, P=0.005)的相关性更为显著,相关系数更高。三种共表达细胞,IL-21+IFN-γ+CD4+T细胞频数与MELD积分呈正相关；IL-21+IL-10+CD4+和IL-21+IL-17A+CD4+T细胞频数与TBIL和MELD积分呈正相关,而与ALB呈负相关；其余各指标间无显著相关性。血清IL-21. IFN-γ、IL-10、IL-17A浓度与外周相应因子分泌细胞频数的相关性。共有55例研究对象同时接受了CBA检测血清中IL-21、IFN-γ、IL-10、IL-17A蛋白浓度和ICS检测外周分泌四种细胞因子的CD4+T细胞频数。对两种检测的结果进行Spearman相关性分析,发现只有血清IL-21浓度与IL21+CD4+T细胞频数呈正相关(r=0.482, P0.001);IFN-y与IFN-y+CD4+T细胞(r=-0.067, P=0.627)、IL-10与IL-10+CD4+T细胞(r=0.114,P=0.406). IL-17A与IL-17A+CD4+T细胞(r=0.073,P=0.596)均无显著相关性。说明外周血中的IL-21主要由CD4+T细胞分泌,而IFN-γ、IL-10和IL-17A的来源则相对广泛。第三部分：IL-21对PBMC分泌其它细胞因子的影响。血清IL-21水平与其它细胞因子浓度的相关性分析。对第一部分CBA检测103份血清中各细胞因子的浓度进行相关性分析,发现IL-21与IL-1p(r=0.252,P=0.010)、IL-2(r=0.426, P0.001)、IL-4(r=0.278, P=0.004)、IL-6(r=0.532, P0.001)、IL-8(r=0.2424, P0.001)、IL-10(r=0.207, P=0.036)、IL-12p70(r=0.451, P0.001)、IL-17A (r=0.330, P=0.001)、IFN-γ (r-0.362, P0.001)和TNF-α (r=0.303,P=0.002)均呈正相关,但与IL-12/IL-23p40(r=-0.207, P=0.785)无显著相关性。 IL-21体外对PBMC分泌其它细胞因子的影响。无论是对HC还是CHB患者的PBMC, rhIL-21均能显著上调其IL-1p(P=0.009和P0.001)、IL-6(P=0.006和P0.001)、IL-10(P=0.002和P0.001)、IFN-γ(P=0.006和P=0.001)和TNF-α(均P=0.042)的表达,并呈现剂量依赖效应。rhIL-21对IL-2和IL-12p70的分泌也有轻微促进作用,而对IL-8则有轻微抑制作用,尽管两者均无统计学差异。结论与讨论相比于M-CHB和S-CHB患者,HB-ACLF患者血清IL-21水平显著升高,且未存活患者高于存活患者,而随着病情恢复,血清IL-21水平又逐渐下降,说明IL-21参与HB-ACLF的病理生理过程。血清IL-21水平与反映肝脏疾病严重程度的临床指标(如TBIL. PTA和MELD积分等)显著相关,并且对HB-ACLF的预后具有一定的判断价值,提示血清IL-21有可能作为反映HB-ACLF肝脏疾病严重性和判断预后的新的生物学指标。 HB-ACLF和S-CHB患者外周IL-21分泌细胞的频数显著高于M-CHB和HC,随病情恢复而逐渐减少,并且与反映肝脏疾病严重程度的临床指标相关,进一步说明IL-21分泌细胞可能与肝脏严重的炎症活动有关。体外rhIL-21能够促进IL-1β、IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α的分泌,提示IL-21可能通过调节其它免疫细胞功能、上调前炎症因子的表达的方式参与肝脏炎症活动。上述证据表明,IL-21参与HB-ACLF的病理生理过程,血清IL-21水平有可能作为评估疾病严重性和判断预后的良好指标,阻断IL-21通路或许是早期干预HB-ACLF发生发展的一个新的治疗靶点。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R512.62;R575.3

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