HPPCn相互作用的膜蛋白筛选

发布时间：2020-06-07 03:37

【摘要】： 哺乳动物肝脏具有非常强大的再生能力。通常情况下,人的肝脏在受损后,3天内启动肝再生,2-3周后可以基本恢复肝脏功能,3-6个月后肝脏可恢复到与受损前一样大小。肝脏再生是一个复杂的过程,成千上万的物质参与了这个过程。近两年,我们实验室的研究人员利用传统的生化分离与现代蛋白质组学相结合的分离方法从新生小牛肝脏中分离到一个能够特异的促进肝细胞增殖的蛋白因子,将其命名为HPPCn(hepatopoietin Cn, HPPCn)。随后,又从人胎肝cDNA文库中筛到了它的人源序列。生物活性分析显示,重组人HPPCn蛋白能够特异地促进原代培养大鼠肝细胞、正常肝细胞系L02和肝癌细胞系SMMC7721的DNA合成和细胞分裂,而且能够促进70%肝脏切除小鼠的肝再生,初步的动物实验显示重组HPPCn蛋白对乙醇诱导的急性肝损伤有明显的保护作用。序列分析显示,HPPCn与富含亮氨酸的酸性核蛋白(Leucine-rich acidic nuclear protein,LANP)家族其他成员序列同源性达到70%以上,且同已知的LANP蛋白一样,具有保守并且特殊的结构特征:1)其N端含有一个由25个亮氨酸组成的高度重复序列,称之为富含亮氨酸重复序列(leucine rich-repeats,LRRs),它具有特征性的βαβ的马靴型结构,有利于蛋白与蛋白之间的相互作用;2)C端第169-230位的氨基酸残基是一段由谷氨酸与天冬氨酸组成的重复序列,称之为酸性尾结构(acidic tail domain),这有利于它们在核内与染色体相结合,从而调控基因的转录。蛋白质结构分析显示,HPPCn拥有核蛋白的结构特点,但是它又不具有典型的信号肽结构,那么它是如何作为一个生长因子来发挥作用的呢?在已有的报道中,相当数量的核蛋白(如HMGB1,HDGF等)能够同时在细胞内外发挥作用,属于一类可在核内外同时发挥作用的双功能细胞因子。HPPCn与其有极其相似的结构,这种结构的相似性,能否产生功能的相似性?即HPPCn是否具有能在细胞内外同时发挥作用的双功能性?前期的实验表明,FITC标记的重组HPPCn蛋白与肝细胞表面呈斑块样特异性结合,并能激活细胞中增殖相关的激酶活性,如SPK,MAPK,STAT3。流式分析显示,不论是结合实验还是竞争性抑制实验,均表明HPPCn能够与肝细胞特异结合。本研究主要目的是寻找HPPCn相互作用的的膜蛋白。我们首先制备了携带His标签的HPPCn蛋白,并利用改进的His Pull-down的方法寻找HPPCn相互作用的膜蛋白,通过免疫共沉淀,转染细胞等方式对他们的相互作用做了进一步验证。具体的实验方法如下: 首先,表达纯化带His标签的HPPCn蛋白并分离肝癌细胞系SMMC7721的膜蛋白。构建带His标签的HPPCn的原核表达载体pET-24a(+)-HPPCn,并将其转入大肠杆菌BL21,构建表达带His标签的HPPCn重组蛋白的工程菌,利用工程菌发酵生产大量带His标签的HPPCn蛋白,并通过Q-XL阴离子交换层析和His亲和层析进行蛋白纯化。通过蔗糖密度梯度离心的方法获得肝癌细胞系SMMC7721的膜蛋白。第二,通过改进的His Pull-down方法,寻找HPPCn相互作用的膜蛋白。将光敏感交联剂SANPAH、带His标签的HPPCn蛋白与提取的膜表面蛋白一起用紫外照射,由于化学键的断裂重新连接,带His标签的HPPCn蛋白与提取的膜表面蛋白进行交联,超速离心分离交联复合物。His亲和层析进一步纯化交联复合体,得到带His标签的HPPCn蛋白和交联复合体的混合物, SDS-PAGE电泳对其进行分离,并进一步通过Western blot用抗His的抗体和抗HPPCn的抗体对分离的条带进行专一性鉴定,与相应的SDS-PAGE电泳结果比对找到目的条带,割胶回收,质谱鉴定。最后,进一步验证HPPCn与角蛋白8/18之间的相互作用。我们首先用角蛋白8/18抗体通过细胞免疫组化的方式,对SMMC7721细胞表面的角蛋白8/18的分布进行分析。通过细胞外的结合实验和免疫共沉淀进一步确定两者之间的相互作用。为了在细胞内确定HPPCn与角蛋白8/18相互作用的存在,将角蛋白8/18的表达载体pCDNA3.1-K8-IRES-K18转入HPPCn作用阴性的小鼠成纤维细胞系NIH-3T3,筛选稳定表达株,观察HPPCn对其是否有促增殖抗凋亡的活性。实验结果显示,通过不同浓度IPTG,不同诱导时间诱导,最后确定0.3mM IPTG,诱导4小时,工程菌可以大量表达带His标签的HPPCn,因此表达带His标签的HPPCn的工程菌构建成功。大量摇瓶培养,收集菌体超声破碎,得到的超声上清经过Q-XL阴离子交换层析和His亲和层析,去除大部分杂蛋白,获得较为纯净的带His标签的HPPCn,灰度扫描纯度达到90%以上,符合后续实验的要求。通过蔗糖密度梯度离心的方法逐级分离大量的肝癌细胞系SMMC7721的膜蛋白,为后续两者的相互作用奠定基础。通过改进的His Pull-down和质谱相结合,筛选到HPPCn相互作用的膜蛋白角蛋白8/18。免疫组化实验确定了角蛋白8/18在膜表面的分布,PVDF膜上的蛋白结合实验和免疫共沉淀结果验证了HPPCn与角蛋白8/18的相互作用。通过角蛋白8稳定转染株的初步实验发现HPPCn对转化了pCDNA3.1-K8表达载体的NIH-3T3细胞系促增殖作用不太明显。角蛋白8/18是正常成年人肝细胞中唯一的中间纤维蛋白。越来越多的实验发现,角蛋白8/18不仅能够对抗机械压力,而且可以对抗各种毒素压力以及Fas介导的细胞凋亡。而临床数据显示,角蛋白8/18特定氨基酸残基的突变将会导致各种肝脏疾病。分子机制研究发现,角蛋白8/18一方面可以与各种骨架相互蛋白作用维持细胞形态,另一方面与各种激酶、接头蛋白和细胞凋亡蛋白相互作用构成复杂的信号通路系统。因此角蛋白8/18在研究肝脏细胞对抗毒素压力,细胞凋亡以及各种肝脏疾病方面有重要的意义。本研究通过His Pull-down的方法获得与HPPCn相互作用的膜蛋白角蛋白8/18,并通过进一步的免疫共沉淀等体外验证实验初步证实了两者的相互作用。构建了角蛋白8/18的真核表达载体,转染HPPCn作用阴性的NIH-3T3细胞。角蛋白8的单独表达解除了HPPCn对NIH-3T3细胞生长的抑制作用。
【图文】：

质粒图谱,标签,亲和层析,细体

新的肝细胞刺激因子。由于 HPPCn 结构的独特性，子，一方面在核定位信号作用下，进入核内发挥其转特定的条件下，通过某一种特殊途径分泌或释放到细体蛋白结合，发挥其促增殖活性。为了寻找 HPPCn构建了带 His 标签的 HPPCn（His-HPPCn）的-His-HPPCn 质粒，并将其转化到大肠杆菌 BL21（DE His 标签的 HPPCn 工程菌。通过 IPTG 诱导，大量表过 Q-XL 阴离子亲和层析和 His 亲和层析得到较为纯膜蛋白的分选是通过密度梯度离心的方式获得的。材料质粒载体标签的原核表达载体 pET-24a(＋)载体由本实验室保存

酶切鉴定,质粒,工程菌,中间层

加入超速离心管内，上层用 C 液填满，70000 g 离心 6精细提取，用 C 液重新溶解中间层，，后加入适当的 D溶液，上层用 C 液填满，23000 g 离心 60 min。收集中洗涤，吸取中间层液体，用 PBS 重悬，18000 g 超速离重悬，用 PBS+1% NP-40+1%CHAPS 重悬，轻微超声实验结果工程菌BL21(DE3)-pET-24a (+)-His-HPPCn鉴定结果工程菌 BL21(DE3)-pET-24a (+)-His-HPPCn 为实验室已，为确认该菌株的可靠性，提取质粒，对其进行了酶(1) 酶切鉴定结果图 1-1 所示，经 XhoI 和 NotI 双酶切，1.2 %琼脂糖凝。
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R575

【参考文献】