固有免疫分子TRIM22对乙型肝炎病毒的抑制作用及其机制研究

发布时间：2020-06-08 01:54

【摘要】：乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染是世界性的卫生难题,它能引起肝炎、肝硬化、甚至肝癌,严重危害人类健康。迄今为止尚未发现有效的治疗措施。HBV是很小的包膜病毒,其基因组结构精密,约3,200个碱基对(bp)。HBV含有4个开放读码框架(ORF),分别命名为C、S、P、X区。C区编码核心抗原和E抗原:核心抗原是病毒核衣壳的主要组成成份,E抗原则可能在病毒感染过程中起到免疫调节作用。S区编码的是表面抗原,可能与病毒粘附到细胞表面有关。P区编码的是病毒DNA多聚酶,该酶也是一种逆转录酶。X区编码的是一转录活化子。这些基因的表达受到四个启动子的调控(包括两个表面抗原启动子、一个core启动子和一个X启动子)。 TRIM22(Tripartite Motif Protein 22),又名为Staf50(stimulating transactingfactor,50 kDa),是TRIM蛋白家族成员之一。TRIM蛋白也称为RBCC蛋白,从其蛋白肽链的N端到C端依次包括一个RING结构域,一个或两个B-box结构域和一个coiled-coil结构域,部分TRIM分子在C末端还有SPRY结构域。现已发现近70个TRIM蛋白家族成员,它们与机体多种生理过程有关,如细胞增殖、分化、发育、癌变和凋亡等。近年研究发现,越来越多的TRIM家族分子(如TRIM5α、TRIM19、TRIM25和TRIM28等)在抗病毒固有免疫中起到重要作用,且许多TRIM家族分子亦可被干扰素(interferon,IFN)诱导上调,这提示TRIM家族蛋白可能是一类广泛存在的新型抗病毒固有免疫分子。在正常生理情况下,TRIM22主要在外周血单个核细胞、淋巴组织以及卵巢中高表达,有研究表明TRIM22与淋巴细胞的活化和骨髓红细胞的分化有关。在其他组织器官(包括肝脏)中,TRIM22仅有基础表达,但有研究证实干扰素和p53可在某些细胞系中明显上调TRIM22基因的表达。TRIM22可抑制HIV-1长末端重复序列引发的转录,并可在某些细胞系中抑制HIV-1的复制,这提示TRIM22具有抗病毒作用,是又一具有抗病毒功能的TRIM蛋白。尤为值得关注的是:急性HBV感染猩猩的肝脏基因表达谱分析发现,TRIM22在HBV清除过程中被诱导表达上调,是与HBV清除相关的基因之一,这提示TRIM22在HBV的自然感染过程中可能发挥了抗病毒作用,但TRIM22是如何被诱导表达上调以及它在HBV清除过程中所发挥的作用还不清楚。本课题将研究TRIM22基因的诱导表达机制,并通过体外、体内乙肝模型来研究TRIM22的抗HBV作用以及对TRIM22分子抗病毒机制进行探讨。第一部分干扰素和p53在人肝细胞中对TRIM22的诱导表达 TRIM22在某些细胞株中是干扰素诱导基因,已知干扰素可以非杀细胞的方式抑制HBV的基因表达与复制,但干扰素的效应蛋白及其清除病毒的详细分子机制仍不十分清楚。那么干扰素是否可能通过上调TRIM22的表达来实现其抗HBV的作用呢?为研究TRIM22是否可在肝细胞中被干扰素诱导上调表达,我们首先利用不同剂量的重组人IFN-α或IFN-γ对高分化的人肝细胞系HepG2细胞刺激相应时间,再通过实时定量RT-PCR技术检测干扰素对TRIM22 mRNA诱导表达。结果发现,HepG2细胞中TRIM22的基础表达值低,但可被IFN-α和IFN-γ以剂量依赖的方式明显上调表达,IFN-γ对TRIM22的诱导表达能力稍弱于IFN-α;IFN-α表达的峰值在24 h左右,而IFN-γ对TRIM22的诱导表达则呈时间依赖性。为进一步验证该现象,我们利用IFN-α或IFN-γ对另外一株人肝细胞系Huh7进行刺激,再通过实时定量RT-PCR检测TRIM22 mRNA的表达情况,结果发现IFN-α或IFN-γ亦能明显上调Huh7细胞中TRIM22 mRNA的表达,与HepG2细胞相类似的是,IFN-γ对TRIM22的诱导表达能力稍弱于IFN-α。提示IFN-α或IFN-γ可上调表达人肝细胞系中TRIM22 mRNA的表达。为进一步研究干扰素是否可在蛋白水平上诱导TRIM22的表达,我们将TRIM22多肽与钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联,免疫兔制备抗血清;再通过免疫亲和层析法纯化出TRIM22多肽特异性抗体。利用该抗体对IFN-α或IFN-γ处理的与未处理的HepG2细胞进行免疫印迹检测。结果发现,与未经干扰素处理的HepG2细胞相比较,IFN-α或IFN-γ可明显上调HepG2细胞中TRIM22蛋白水平的表达。 p53可在某些细胞株中上调TRIM22的表达,p53亦可有效抑制HBV的转录复制。为研究p53是否可在肝细胞中诱导TRIM22的表达,我们用紫外线(UV)处理HepG2细胞以诱导内源性p53的表达,通过实时定量RT-PCR检测TRIM22的表达水平。结果发现UV处理HpG2细胞后p53基因表达增加,并明显上调了TRIM22的表达。为进一步研究p53是否可直接上调HepG2细胞中TRIM22的表达,我们将野生型p53真核表达质粒pCMV-p53和pCMV空质粒转染HepG2细胞,48 h后通过实时定量PCR技术检测TRIM22的表达。结果发现,与空质粒组相比较,pCMV-p53处理组的TRIM22表达明显上调。提示在内源性和外源性p53的刺激下,HepG2细胞中的TRIM22基因均可明显上调表达。第二部分TRIM22对HBV抑制作用研究为研究干扰素诱导表达的、p53靶基因TRIM22是否具有抑制HBV的能力,我们将TRIM22的真核表达质粒与复制型HBV质粒共转染HepG2细胞,通过ELISA检测转染细胞上清中的HBsAg和HBeAg含量,Northern blot检测转染细胞中的HBV转录本,Southern blot检测转染细胞中的HBV复制中间体。结果发现TRIM22可明显降低HBsAg和HBeAg的合成。与空质粒处理组相比较,转染三天后,TRIM22真核表达质粒处理组的HBsAg约降低了75%,HBeAg约降低了60%。在TRIM22抗HBV的剂量效应实验中发现,TRIM22可以剂量依赖的方式明显抑制HBV的蛋白合成。Northern blot结果发现,TRIM22可显著降低HBV的转录本水平。Southern blot结果发现TRIM22可明显下调HBV的复制中间体水平。为排除TRIM22对HBV的抑制作用是由该基因对细胞的毒性所导致,我们观察了转染细胞形态与生长速度,并通过BCA法检测了转染细胞的蛋白含量,结果发现与空质粒处理组细胞相比较,TRIM22真核表达质粒处理组细胞的形态、生长速度及总蛋白浓度均没有明显差异。提示TRIM22可在乙肝细胞模型中有效抑制HBV基因的表达与复制。为进一步研究TRIM22是否亦在体内具有抗HBV的功能,我们通过高压注射法将TRIM22真核表达质粒与复制型HBV质粒共转染Balb/C小鼠。结果发现,TRIM22可明显降低小鼠血清中HBsAg和HBeAg的含量。与空质粒处理组相比较,转染四天后,TRIM22真核表达质粒处理组小鼠血清中的HBsAg和HbeAg分别降低了65%和55%。免疫组化结果表明TRIM22可明显抑制小鼠肝脏中HBcAg的表达。Northern blot结果发现,TRIM22可显著降低小鼠肝脏中HBV的转录本水平。为排除TRIM22在小鼠体内对HBV的抑制作用是由于TRIM22对肝脏的毒性作用所导致,我们检测了注射质粒后小鼠血清中的ALT含量。结果发现,空质粒处理组与TRIM22真核表达质粒处理组小鼠在血清ALT水平上并无差异。提示TRIM22亦可在小鼠乙肝模型中抑制HBV的基因表达。为研究了TRIM22的RING结构域和SPRY结构域在抗HBV的过程中所起的作用,我们以野生型TRIM22真核表达质粒为模板,采用定点突变技术将TRIM22 RING结构域第15位半胱氨酸突变成丙氨酸(C15A),并构建了SPRY结构域缺失的TRIM22真核表达质粒。采用磷酸钙沉淀法将野生型及突变型TRIM22真核表达质粒与复制型HBV质粒共转染HepG2细胞,3天后检测转染细胞上清中HBsAg和HBeAg的表达量。结果发现将RING结构域保守的第15位半胱氨酸突变成丙氨酸或将SPRY结构域缺失后,TRIM22对HBV的抑制功能基本消失。为排除TRIM22突变体对HBV基因表达抑制能力的下降是由于突变体蛋白表达水平的下降所致,我们通过Western blot检测了TRIM22野生型和突变体在转染细胞中的蛋白表达量,结果发现野生型TRIM22和TRIM22突变体在蛋白水平上的表达基本一致。提示RING和SPRY结构域对TRIM22的抗HBV能力起到关键作用。第三部分TRIM22抗HBV的作用机制为研究TRIM22是否可抑制HBV启动子的活性,我们构建了4个HBV启动子依赖的荧光素酶报告质粒(SpLUC、XpLUC、CpLUC和PS(1)pLUC)。通过磷酸钙沉淀法将TRIM22真核表达质粒与4个HBV启动子依赖的荧光报告质粒共转染入HepG2细胞,48 h后检测转染细胞裂解液中的荧光素酶。结果发现,TRIM22可下调HBV四个启动子的活性,其中S启动子活性约下调75%,Core启动子活性约下调65%,pre-S启动子活性约下调42%,X启动子活性约下调28%,而TRIM22 RING结构域保守半胱氨酸点突变体和SPRY结构域缺失突变体对HBV启动子活性的抑制作用基本消失。提示TRIM22可在转录水平上抑制HBV的基因表达。由于以往研究发现某些细胞因子,如干扰素、TNFα,亦可抑制HBV启动子的活性,而NF-κB和IFN-β信号通路的活化对这些炎性细胞因子的产生起到至关重要的作用,为此我们对TRIM22在HepG2细胞中对NF-κB和IFN-β启动子活性的可能影响进行了研究。为研究TRIM22在HepG2细胞中对NF-κB启动子活性的影响,我们将TRIM22和RIG I(2CARD)的真核表达质粒分别与NF-κB启动子依赖的荧光素酶报告质粒共转染HepG2细胞,转染42 h后在TNF处理组加入TNF-α至终浓度为1000 U/ml,继续培养6 h,收集细胞检测细胞裂解液中荧光素酶活性。结果发现TRIM22不能在HepG2细胞中上调NF-κB启动子的活性,而TNF-α和RIGI(2CARD)在HepG2细胞中上调NF-ΚB启动子活性的倍数分别为15.5和2.1倍左右。提示TRIM22不能在HepG2细胞中有效活化NF-κB信号通路。为研究TRIM22在HepG2细胞中对IFN-β启动子活性的影响,我们将TRIM22真核表达质粒和RIG I(2CARD)真核表达质粒分别与IFN-β启动子依赖的荧光素酶报告质粒共转染HepG2细胞,转染48 h后收集细胞检测细胞裂解液中荧光素酶活性。结果发现TRIM22不能在HepG2细胞中上调IFN-β启动子的活性,而RIG I(2CARD)在HepG2细胞中上调IFN-β启动子活性的倍数为13.5倍左右。提示TRIM22不能在HepG2细胞中有效活化IFN-β信号通路。 TRIM分子的细胞定位与其功能的发挥密切相关。为研究TRIM22在HepG2细胞中的定位,我们通过磷酸钙沉淀法将野生型、RING结构域第15位半胱氨酸突变成丙氨酸及SPRY结构域缺失的TRIM22真核表达质粒转染入HepG2细胞,转染48 h后通过间接免疫荧光法检测野生型TRIM22和TRIM22突变体在HepG2细胞中的定位。结果发现,野生型和RING结构域点突变的TRIM22蛋白主要定位在细胞核,而SPRY结构域缺失的TRIM22蛋白则定位在胞浆。提示TRIM22蛋白主要定位在HepG2细胞核中,而SPRY结构域对TRIM22蛋白的细胞定位起到关键作用。为研究内源性TRIM22蛋白在HepG2细胞中的定位,我们利用TRIM22多肽特异性抗体分别对HepG2细胞的胞浆与胞核提取物进行免疫印迹检测,结果发现内源性TRIM22蛋白亦主要定位在核内。TRIM22蛋白主要定位在肝细胞核与其作为转录抑制因子发挥抗HBV作用相符。综上所述,我们的研究发现TRIM22可在人肝细胞系中被干扰素和p53诱导上调表达;TRIM22可在体外细胞模型和体内小鼠模型中抑制HBV基因的表达与复制。TRIM22可抑制HBV启动子的活性,细胞定位研究发现TRIM22蛋白主要定位在HepG2的细胞核中,这提示TRIM22可能作为转录抑制因子来发挥抗HBV的作用。本研究有助于进一步阐明机体抗HBV感染机制,且基于固有免疫分子TRIM22的抗HBV感染策略可能具有潜在的应用价值。
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R512.6

【共引文献】