内质网分子伴侣PDI在非酒精性脂肪性肝病中的作用及机制研究

发布时间：2020-06-08 07:40

【摘要】：研究背景及目的：近年来,随着经济水平的提高,生活方式的改变,非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)已成为我国导致慢性肝病的重要原因之一,其中,非酒精性单纯性脂肪肝是一种良性病变,而非酒精性脂肪性肝炎则会进展为肝纤维化、肝硬化甚至肝癌等终末期肝病。目前,NAFLD的发病机制尚不明确,已有一些研究表明,肝细胞凋亡是促进其进展的重要病理生理改变,且程度与疾病严重程度呈正相关,但其中的机制仍未完全阐明。研究证实,过度的内质网应激易导致细胞功能障碍及细胞凋亡,而内质网上的分子伴侣或许可以影响此过程。蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase, PDI)是一种定位于内质网管腔的分子伴侣,在NAFLD中PDI是否可影响内质网应激所诱导的细胞凋亡过程,目前尚未见文献报道。本研究旨在通过体外实验的方法,探索PDI在此过程中所起的作用,同时试图阐明其可能的机制。方法： (1)细胞培养和转染：HL-7702细胞用加入了10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养,并置于含5%CO2的37℃恒温培养箱中。传代至状态良好时,消化后铺至12孔板中,按LipofectamineTM 2000说明书进行转染操作。72h后改用1mM FFA高脂培养基继续培养24h。 (2)油红O染色：吸去培养基,用PBS轻柔漂洗后加入12%中性甲醛固定15min,然后用油红稀释液染色15min,60%异丙醇漂洗后用苏木素复染5min,显微镜下观察并拍照。 (3) Western Blot检测：收集12孔板中的细胞并提取蛋白,将各组蛋白加入相应泳道后进行SDS-PAGE电泳,然后将蛋白转至PVDF膜上,封闭1 h,一抗4℃孵育过夜,再用二抗孵育后行ECL法检测,最后用凝胶成像系统拍照。 (4)细胞凋亡检测：细胞用冷的PBS洗两次并重悬后,加入适量的Annexin V和PI染色,混匀后避光孵育15min,孵育后加入1×buffer 400ul,用流式细胞仪完成检测。结果： (1)油红O染色：与对照组相比,FFA脂变诱导组细胞胞浆内可见大量红染的脂滴,但经高脂培养基诱导的三组,即单纯FFA诱导组、PDI-negative siRNA+FFA诱导组及PDI-siRNA Mix+FFA诱导组组间差异不明显。 (2)细胞凋亡结果：与对照组相比,单纯FFA诱导组、PDI-negative siRNA+FFA诱导组、PDI-siRNA Mix+FFA诱导组的细胞凋亡比例依次升高。 (3)内质网应激及凋亡相关指标：与对照组相比,GRP78在单纯FFA诱导组、PDI-negative siRNA+FFA诱导组及PDI-siRNA Mix+FFA诱导组的表达均增高,并以PDI-siRNA Mix+FFA诱导组增高最明显。而CHOP在对照组、单纯FFA诱导组、PDI-negative siRNA+FFA诱导组及PDI-siRNA Mix+FFA诱导组的表达是依次增高的。另外,IRE1在各组表达情况无明显差异。结论： (1)PDI表达下调能加重内质网应激程度； (2)PDI表达下调能加重由内质网应激诱导的细胞凋亡； (3)在HL-7702细胞中,内质网应激可能主要通过上调CHOP表达诱导细胞凋亡发生； (4) PDI可能不影响细胞发生单纯脂变的过程。
【图文】：

模型图,高脂,培养基,脂滴

3.1脂肪变细胞模型的构建细胞贴壁后，除对照孔外，余孔改用lmMF队高脂培养基分别培养24h、48h、72h，到相应时间点后用油红O染色，并用倒置显微镜观察、拍照(图3.1)。对照组 24hFFA组 48hFFA组 72hFFA组图3.1高脂培养基诱导的脂变细胞模型对照组:细胞边缘清晰，胞浆丰富，核膜完整，核大，可见核分裂相，油红O染色后仅见少量且较小的红染的脂滴。F队脂变诱导组:细胞变圆，核大，部分细胞核被挤到一侧，呈印戒样改变，，胞浆内可见大量红染的脂滴;随着诱导时间的延长，脂滴逐渐增大。因24h脂变诱导已有较明显的效果，且有相应文献依据[9]，故后续实验将脂

内质网分子伴侣PDI在非酒精性脂肪性肝病中的作用及机制研究

PDI一siRNA敲低效果检测
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R575.5

【参考文献】