高迁移率蛋白B1在急性肝功能衰竭中的作用及机制研究

发布时间：2020-06-09 05:23

【摘要】： 目的：构建含全长HMGB1及HMGB1 A盒蛋白基因的原核表达质粒,并分离纯化出相应的蛋白。 方法：从正常小鼠肝脏中提取总RNA为模板,设计2对引物,经PCR转录出全长HMGB1及HMGB1-A盒基因片段；利用克隆载体PMD-18T构建克隆载体PMD-18T-HMGB1和PMD-18T-HMGB1-Abox,由公司测序确定为正确序列,经BamH、Xol I (Hand III)双酶切后,与同样双酶切的原核载体PET-28a连接,最终得到带6-His标签的小鼠PET28a-HMGB1与PET28a-HMGB1-Abox原核质粒；测序证实后,将该质粒转化至大肠杆菌BL21,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(ITPG)诱导后经镍离子亲和层析柱亲和纯化得到目的蛋白HMGB1及HMGB1-Abox。 结果：构建的全长HMGB1与HMGB1-A盒基因的原核质粒,经双酶切、PCR、测序证明各基因均正确的插入到原核质粒中且读码框未发生移位；诱导纯化分离出的蛋白经SDS-PAGE及BAC法检测证实为目的蛋白,即全长HMGB1蛋白与HMGB1-A盒蛋白。 结论：成功构建小鼠原核质粒PET28a-HMGB1与PET28a-HMGB1-Abox,并得到纯度较高的重组HMGB1蛋白与HMGB1-A盒蛋白。 目的：观察重组HMGB1蛋白在体内外对炎症反应的作用。 方法：体外实验：以不同浓度的重组HMGB1蛋白单独或联合LPS作用于小鼠单核细胞系RAW264.7,CCK8试剂盒检测其对小鼠单核细胞活力的影响。以LPS和重组HMGB1蛋白联合为实验组1,重组HMGB1蛋白及LPS单独作为实验组1’及对照组,空白组给予PBS。于2、6、12、24、48h检测其细胞上清中的TNF-a,IL-1β的含量,WESTBLOT、免疫荧光法观察细胞中HMGB1的表达、RT-PCR检测细胞中HMGB1-mRNA变化趋势。体内试验：试验小鼠随机分为4组,对照组用脂多糖和D-氨基半乳糖胺制备小鼠急性肝衰竭模型,实验组1在此基础上给予腹腔注射重组HMGB1蛋白,实验组1’仅腹腔注射重组HMGB1蛋白,空白组仅腹腔注射等渗盐水,于2、4、6、8、12、24h免疫组织化学检测其肝组织中HMGB1表达的变化情况、逆转录-PCR检测其HMGB1-mRNA变化趋势、ELISA检测血清中TNF-a,IL-1β的含量。以上数据通过配对t检验进行统计学比较。 结果：体外实验：小鼠单核细胞活力与重组HMGB1蛋白浓度及作用时间呈负相关；与空白组相比,实验组1、1’与对照组细胞上清TNF-a、IL-1β的含量显著增高,二者均具有统计学差异(P0.05)；WESTBLOT及免疫荧光检测提示实验组1细胞中HMGB1表达不断增加；细胞中HMGB1-mRNA含量及峰值均较空白组与对照组显著增前。体内试验：添加重组HMGB1蛋白的实验组肝组织中肝脏坏死情况明显恶化并加速,HMGB1和HMGB1-mRNA的表达较对照组增高且表达时间提前；实验组1TNF-a于2h开始上升,12h达到峰值(545.84±25.01)pg/ml,明显高于实验组1’(398.73±35.29pg/ml)和对照组(473.42±22.99pg/ml),两组比较P0.05；实验组1 IL-1β血清IL-1β在2h就达到峰值(1016.27±26.98pg/ml),同样高于其余三组P0.05。而实验组1’和对照组之间则不存在统计学差异,二组之间水平相近,仅在峰值时间上略有不同。 结论：重组HMGB1蛋白在体外可以增加小鼠单核细胞在受到LPS刺激时HMGB1的表达和分泌；在体内可以显著增加急性肝衰竭时肝组织HMGB1的表达和分泌,极大地促进炎症反应的发生、加速炎症反应的发展。 目的：观察重组HMGB1-Abox蛋白在体内外对炎症反应的抑制作用。 方法：体外实验：以不同浓度的重组HMGB1-Abox蛋白作用于LPS刺激的小鼠单核细胞系RAW264.7,CCK8试剂盒检测其对小鼠单核细胞活力的影响。以PBS和重组HMGB1-Abox蛋白为对照组和实验组,于2、6、12、24、48h检测其细胞上清中的TNF-a,IL-1p的含量,WESTBLOT、免疫荧光法观察细胞中HMGB1的表达、RT-PCR检测细胞中HMGB1-mRNA变化趋势。体内试验：用脂多糖和D-氨基半乳糖胺制备小鼠急性肝衰竭模型,对照组腹腔注射等渗盐水,实验组腹腔注射重组HMGB1-Abox蛋白,于2、4、6、8、12、24h免疫组织化学检测其肝组织中HMGB1表达的变化情况、逆转录-PCR检测其HMGB1-mRNA变化趋势、ELISA检测血清中TNF-a,IL-1β的含量。以上数据通过配对t检验进行统计学比较。 结果：体外实验：小鼠单核细胞活力与重组HMGB1-Abox蛋白浓度及作用时间呈正相关；实验组细胞上清TNF-a、IL-1β的含量较对照组显著下降：对照组TNF-α一直保持上升趋势直至48h达到峰值(6156.86±75.21pg/mL)；IL-1β在12h时即达到峰值(3426.03±30.54pg/mL),随后缓慢下降。实验组TNF-α48h到达峰值(4237.72±63.89pg/mL)；IL-1β在24h升至顶峰(3164.99±53.56pg/mL),均较对照组显著下降,二者具有统计学差异(P0.05)；WESTBLOT及免疫荧光检测提示实验组细胞中HMGB1表达不断减少；细胞中HMGB1-mRNA含量及峰值均较对照组显著减少且延后。体内试验：实验组肝组织中肝脏坏死情况明显好转,HMGB1和HMGB1-mRNA的表达较对照组降低且表达时间延后；实验组TNF-a于4h开始上升,12h达到峰值(334.12±39.13)pg/ml,对照组于8h达到峰值(473.42±22.99)pg/ml,两组比较,t=-11.387,P0.05；实验组IL-1β自2h起随时间延长逐渐增加,在6h达到峰值(341.31±25.01)pg/ml,对照组于2h达到峰值(724.49±34.24)pg/ml,两组比较,t=-7.999,P0.05。 结论：重组HMGB1-Abox蛋白在体外可以降低小鼠单核细胞在受到LPS刺激时HMGB1的表达和分泌；在体内可以显著减少急性肝衰竭时肝组织HMGB1的表达和分泌,有效的阻断HMGB1对其他早期炎性因子的促进作用。
【图文】：

4.1ITPG诱导后的重组HMGBI蛋白在ZIKD大小处有明显增加，经SDS爪AGE电泳，在 20mm0FL咪哇缓冲液洗脱时，出现明显杂带，在200mmo比咪哇缓冲液洗脱时，目的蛋白含量最高，可以得到单一，清晰地条带。见图5。侧..卜A:ITPG诱导前B:ITpG诱导后C:蛋白分子量标准品D:200mmo比咪哇缓冲液洗脱液..，.导D图5重组HMGBI蛋白SDS一PAGE电泳图 4.2ITPG诱导后的重组HMGBI一Abox蛋白在14KD大小处有明显增加，经SDS/RAGE电泳，在 30mmol几咪哇缓冲液洗脱时，出现明显杂带，在50~OUL咪哇缓冲液洗脱时，目的蛋白含量最高，可以得到单一，，清晰地条带。见图6。A:ITPG诱导前B:ITPG诱导后C:蛋白分子量标准品D:SOmmo讥咪哇缓冲液洗脱液图6重组HMGBI一Abox蛋白SDS一以GE电泳图

4.2ITPG诱导后的重组HMGBI一Abox蛋白在14KD大小处有明显增加，经SDS/RAGE电泳，在 30mmol几咪哇缓冲液洗脱时，出现明显杂带，在50~OUL咪哇缓冲液洗脱时，目的蛋白含量最高，可以得到单一，清晰地条带。见图6。A:ITPG诱导前B:ITPG诱导后C:蛋白分子量标准品D:SOmmo讥咪哇缓冲液洗脱液图6重组HMGBI一Abox蛋白SDS一以GE电泳图
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R575.3

【参考文献】

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1 刘辉,姚咏明,董月青,盛志勇;内毒素刺激大鼠腹腔巨噬细胞高迁移率族蛋白B1释放的研究[J];中华实验外科杂志;2005年01期

本文编号：2704223