姜黄素抑制单核细胞浸润并减少单核细胞来源GRN分泌抗肝纤维化的机制研究

发布时间：2020-06-12 10:38

【摘要】：第一部分单核细胞分泌GRN活化HSCs促进肝纤维化机制研究目的:肝纤维化(liver fibrosis)是多种慢性肝病进展的共同病理过程,是我国严重的公共卫生问题。近年来研究表明巨噬细胞,特别是单核细胞来源的巨噬细胞可以促进肝纤维化,但其机制仍不清楚。最新研究显示巨噬细胞可以分泌颗粒体蛋白(granulin,GRN)促进纤维化。本研究旨在揭示巨噬细胞及GRN促进肝纤维化的机制,为肝纤维化的治疗寻求新的靶点。方法:首先我们检测了121例慢性肝病患者CLD肝脏中GRN表达,分析GRN与肝脏炎症、纤维化、临床肝病指标的关系,以及在不同原因肝病患者中的表达差异;然后,我们通过腹腔反复注射CCl4和胆管结扎的方式建立小鼠肝纤维化模型,检测不同纤维化模型小鼠不同时期肝脏中GRN表达变化;利用GRN-/-小鼠建立肝纤维化模型,探索GRN对肝纤维化的作用;利用GRN与肝星状细胞(Hepatic Stellate Cells,HSCs)系-LX-2共培养,通过q-PCR检测平滑肌肌动蛋白α2(smooth muscle actin alpha 2,ACTα2)和I型胶原α1(collagen type I alpha l,Collα1)等指标,观察GRN对HSCs活化的影响,通过WB检测ERK1/2、P-38、JNK、AKT和NF-κB等蛋白表达和磷酸化水平,探索GRN活化HSCs的机制;利用GRN与巨噬细胞表面分子CD68、F4/80和CD11b荧光共染,观察在肝纤维化期肝脏中GRN表达来源;利用脂质体尾静脉注射去除掉小鼠肝巨噬细胞,观察去除掉巨噬细胞后小鼠肝脏中GRN表达;利用野生型小鼠和GRN-/-小鼠的骨髓单核细胞和肝脏原代HSCs共培养,观察单核细胞来源的巨噬细胞对小鼠肝星状细胞的活化作用。结果:在CLD患者肝脏中GRN表达较普通人明显升高,且与肝脏炎症呈正相关,不同病因之间无明显差异。与CLD患者肝脏临床指标相关性分析发现,肝组织内中GRN+细胞数量与谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、谷氨酰转肽酶(glutamyl transpeptidase,GGT)、总胆红素(total bilirubin,Tbill)、Child-Pugh评分呈正相关,与白蛋白水平无明显的相关性。在CC14腹腔反复注射和胆管结扎这两种小鼠肝纤维化模型中,GRN表达随着CC14腹腔注射次数增加和胆管结扎时间延长明显增加。在CC14腹腔反复注射建立小鼠肝纤维化模型中,与野生型小鼠相比,GRN-/-小鼠肝脏中α-SMA和Col-1表达明显减轻,炎症因子白介素(interleukin,IL)-4和IL-10降低。GRN与LX-2共培养后,LX-2表达ACTα2和Collαl明显增加,而且ERK1/2和STAT3磷酸化水平明显增加。在CLD患者肝组织免疫荧光中,GRN与CD68共染较普通人明显增多。在普通小鼠肝脏中GRN主要与F4/80荧光共染,而纤维化小鼠模型中GRN与CD11b共染明显增多。相比于普通人CLD患者肝组织切片显示,CD68+细胞数量明显升高。肝纤维化小鼠模型中,F4/80+和CD11b+细胞数量也较空白对照组明显升高。与野生型小鼠相比,GRN-/-小鼠骨髓单核细胞来源的巨噬细胞活化HSCs作用明显减轻。结论:肝纤维化过程中,GRN表达明显升高,与肝脏炎症和纤维化密切相关。拮抗GRN作用后,HSCs活化减轻和肝纤维化缓解。而GRN活化HSCs的作用,与ERK1/2和STAT3磷酸化有关。肝纤维化过程中,GRN主要由单核细胞来源的巨噬细胞分泌。单核细胞来源的巨噬细胞可以通过分泌GRN促进HSCs活化,加重肝纤维化。第二部分姜黄素抑制单核细胞浸润减轻肝纤维化的机制研究目的:既往研究发现姜黄素具有良好的抗肝纤维化作用,但其作用机制尚不清楚。近年来有研究显示姜黄素具有抑制趋化因子分泌和单核细胞浸润的作用。在本研究中,我们旨在研究姜黄素是否可以通过抑制库普弗细胞(Kupffer cells,KCs)活化来减少趋化因子的分泌,从而抑制Ly6Chi单核细胞浸润以及Ly6Chi单核细胞相关的促纤维化细胞因子分泌来缓解肝纤维化。方法:24只小鼠被随机分为三组:空白组、CCl4组和姜黄素组。其中CCl4组和姜黄素组予以CCl4腹腔注射,每周两次,连续四周。空白组小鼠相应予以橄榄油腹腔注射。CMC-NA溶液重悬姜黄素。姜黄素组小鼠每日予以姜黄素灌胃,连续四周,空白组和CCl4组予以相应体积的CMC-NA溶液灌胃。结果:姜黄素给药后,纤维化模型小鼠肝脏炎症和纤维化明显减少。与CCl4组比较,姜黄素组小鼠Ly6Chi单核细胞的肝内浸润明显减少,但其他白细胞亚型无差异。姜黄素显著降低Ly6Chi单核细胞相关促炎性和促纤维化细胞因子分泌,与肝内Ly6Chi单核细胞数量减少相一致。进一步的研究发现姜黄素能够降低KCs活化和肝内单核细胞趋化因子分泌,这解释了姜黄素为什么可以减少肝纤维化过程中的Ly6Chi单核细胞浸润。细胞实验中我们发现姜黄素抑制巨噬细胞向M1型的极化,减少单核细胞趋化因子MCP-1和CCL7的分泌。这与姜黄素抑制ERK1/2和p38通路蛋白磷酸化有关。结论:综上所述,我们首次证实姜黄素可以通过抑制KCs活化来减少趋化因子的分泌,从而抑制Ly6Chi单核细胞浸润以及Ly6Chi单核细胞相关的促纤维化细胞因子分泌来缓解肝纤维化。这些结果提示姜黄素可以作为预防和治疗肝纤维化的候选药物。
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逑１．２邋ＣＬＤ患者肝组织ＧＲＮ＋细胞浸润情况逡逑利用免疫组化的方法，，我们检测了邋ＣＬＤ患者肝组织内ＧＲＮ＋细胞浸润情况。如图１－１Ａ逡逑所示，普通人肝组织内可见肝窦内散在分布的ＧＲＮ＋染色细胞，汇管区周围无阳性染色细逡逑胞。而ＣＬＤ患者肝组织内也可见肝窦内散在分布的ＧＲＮ＋染色细胞，但是在汇管区内可见逡逑大量的ＧＲＮ＋细胞浸润。对ＣＬＤ患者肝组织内ＧＲＮ＋细胞进行统计，可见ＣＬＤ患者肝组逡逑织内ＧＲＮ＋细胞数量（１０５．２３±１０．２２／每高倍视野（ＨＰＦ））较普通人肝组织内ＧＲＮ＋细胞数逡逑量（４０．３３±３．７６／ＨＰＦ）明显增多，差异有统计学意义（图１－１Ｃ）。逡逑Ａ逦Ｂ逡逑ＨＣ（ＳＯＧＯ）逦ＣＬＤ（Ｓ４Ｇ４）逡逑廔．邋琢－逦２５0１逦＇￣￣￣Ｔ＂逡逑｜邋－邋■邋■逡逑ｚ逦｜逦ｉ１５０－逡逑Ｊ逦（、ｉ１００－逡逑／逦＼逦ＨＣ（ｎ＝３０）逦ＣＬＤ（ｎ＝１２１）逡逑＋ｆ．逡逑－邋？＇？：ｖ邋ｖ逡逑．丨丨逦ｉ逡逑图１－１．邋ＣＬＤ患者肝组织和正常肝组织内ＧＲＮ＋细胞浸润。Ａ．邋ＣＬＤ患者肝组织和正常肝逡逑组织内ＧＲＮ＋细胞免疫组化示意图；Ｂ．邋ＣＬＤ患者肝组织和正常肝组织内ＧＲＮ＋细胞浸润阳逡逑性细胞数量统计结果。＊Ｐ＜0．0５，＊＊尸＜０．０１。标尺长度：５０ｆｍｕ逡逑１．３不同病因ＣＬＤ患者肝组织ＧＲＮ＋细胞浸润情况比较逡逑如图１－２所示

逡逑图１－２．不同病因的ＣＬＤ患者肝组织内ＧＲＮ＋细胞比较，＊＊Ｐ＜０．０１。逡逑１．４逦ＣＬＤ患者肝组织中ＧＲＮ＋细胞浸润与肝组织炎症分级和纤维化分期的关系逡逑我们进一步分析ＧＲＮ＋细胞与不同程度的肝脏炎症和纤维化程度的关系。如图１－３所逡逑示，１２１例ＣＬＤ患者中，Ｇ１级患者５４例，Ｇ２级患者３５例，Ｇ３级患者２０例，Ｇ４级患逡逑者１２例。随着Ｇ分级的增高，ＣＬＤ患者肝组织内ＧＲＮ＋比例明显逐渐增高，差异有统计逡逑学意义。１２１例ＣＬＤ患者中，Ｓ０－１期患者５９例，Ｓ２期患者１１例，Ｓ３期患者２０例，Ｓ４逡逑期患者３１例。如图１－３所示，与普通人相比，不同纤维化分期的ＣＬＤ患者，肝组织内ＧＲＮ＋逡逑细胞的数量均较正常对照组明显增多。而不同纤维化分期ＣＬＤ患者之间肝组织内ＧＲＮ＋逡逑细胞数量无明显统计学差异。逡逑Ｉ逦Ｉ逦Ｉ逦Ｉ逦Ｉ逡逑｜｜逦＊＊＊＊＊＊逦＊＊逡逑Ｉ逦Ｉ逦Ｉ逦２５０－，邋Ｉ逦１逦１逦１逦１逡逑２５0邋｜逦＊＊逦？逦２５０邋｜逦－邋？逡逑％邋２００－邋Ｉ邋Ｉ邋１逦｜邋２００＇逦■逦？？逡逑ｉ邋很－＿Ｉ，逦＇逦？邋＾逦Ｉ１５０－逦■■■邋４逦%煎危海垮义希板危垮危殄危颍咤危慑危殄危咤危�逦１逦１逦１逦１逡逑ＨＣ逦ＧＯ－１逦Ｇ２逦Ｇ３逦Ｇ４逦ＨＣ逦Ｓ０－１逦Ｓ２逦Ｓ３逦Ｓ４逡逑图１－３．邋ＣＬＤ患者不同炎症分级和纤维化分期肝组织内ＧＲＮ＋细胞数量比�

本文编号：2709409