TLR3基因在BeWo细胞HBV感染和清除中的作用

发布时间：2020-06-14 20:51

【摘要】：目的: ①探讨HBV刺激不同TLR3表达水平的BeWo细胞后,各组BeWo细胞TLR3蛋白表达与HBV感染与复制的关系; ②探讨HBV刺激不同TLR3表达水平的BeWo细胞后,各组BeWo细胞分泌TLR3信号转导过程中相关细胞因子的水平与HBV感染与复制的关系。 方法: ①利用脂质体转染试剂Lipofectamine 2000将抑制TLR3基因的质粒pEGFP-Genesil-tlr3转染入BeWo细胞,以下调BeWo细胞的TLR3表达;用40ug/mlPolyI:C刺激BeWo细胞以上调TLR3蛋白的表达,然后用HBV感染各组细胞; ②本次实验采用BeWo细胞与100ul HBV DNA含量为5.0×106(copies/ml)的病人血清共同培养作为HBV感染的方法,共设立四个组:正常对照组、HBV刺激正常细胞组、HBV刺激抑制TLR3质粒转染组、PolyI:C+HBV刺激组,于HBV刺激各组细胞8h、16h、24h、48h后收集各组细胞的培养上清及细胞进行下一步实验; ③用流式细胞术(FACS)测定以上各组细胞TLR3蛋白的表达量,并分析不同HBV刺激时间点下TLR3蛋白表达水平的变化;用荧光定量PCR法检测HBV刺激后各组细胞培养上清中的HBV DNA载量; ④用酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组细胞培养上清中IL-10、TNF-α、IFN-β的表达。 结果: ①PolyI:C刺激BeWo细胞后,TLR3蛋白表达量增加,其平均荧光强度为65.11±2.73,正常对照组细胞为53.27±4.45,差异有统计学意义(t=-4.536,P0.05)。 ②将抑制TLR3的质粒(pEGFP-Genesil-tlr3)用脂质体转染法转染入BeWo细胞后,其平均转染效率为50.24%。 ③用FACS检测不同时间点(8h、16h、24h、48h)HBV刺激各组BeWo细胞的TLR3蛋白表达量,其在四个实验组中的4个不同时间点上差异均有统计学差异(P0.05)。正常对照组BeWo细胞在4个时间点上TLR3蛋白平均荧光强度分别为52.88、53.78、55.07、54.70;HBV刺激BeWo细胞可使TLR3蛋白水平升高,在8h为62.50,16h为69.65,24h为71.78,48h为73.49,且随时间变化TLR3蛋白表达水平有升高趋势;PolyI:C +HBV刺激组TLR3蛋白表达量高于正常对照组及HBV刺激正常细胞组,8h为77.27,16h为85.36,24h为91.26,48h为88.27,在24h时TLR3蛋白表达量达到高峰;HBV刺激抑制TLR3质粒转染组TLR3蛋白表达量先下降再升高,其在8h为46.19,16h为45.96,24h为46.34,48h为49.55,与正常对照组相比,除在48h差异无统计学意义(P0.05)外,其他时间点均有统计学差异(P0.05)。 ④用荧光定量PCR法检测HBV刺激正常细胞组、PolyI:C+HBV刺激组和HBV刺激抑制TLR3质粒转染组的不同HBV刺激时间点(8h、16h、24h、48h)上各组细胞培养上清中HBV DNA拷贝数,结果显示三组间差异在4个时间点上均有统计学意义(P0.05),且各组均随着HBV刺激时间的延长,HBV DNA拷贝数降低。与HBV刺激正常组相比,PolyI:C+HBV刺激组HBV DNA拷贝数较低,HBV刺激抑制TLR3质粒转染组的HBV DNA拷贝数较高。 ⑤在HBV刺激的4个时间点(8h、16h、24h、48h)上,PolyI:C+HBV刺激组分泌细胞因子IL-10、TNF-α、IFN-β的水平比HBV刺激正常细胞组高,差异均有统计学意义(P0.05);HBV刺激质粒转染组分泌的细胞因子水平低于HBV刺激正常细胞组,不同时间点上差异也均有统计学意义(P0.05)。随着HBV刺激时间的延长,TNF-α表达水平在8h开始上升,24h达到高峰后开始下降;IL-10和IFN-β的表达水平在PolyI:C+HBV刺激组16h后上升幅度较大,其余各组上升较为缓慢。 结论 ①HBV刺激BeWo细胞后其TLR3蛋白表达增加;PolyI:C上调BeWo细胞TLR3蛋白表达水平后在HBV刺激下,TLR3蛋白表达量进一步升高;抑制TLR3质粒转染的BeWo细胞在HBV刺激下TLR3蛋白表达量降低;同时HBV刺激后各组细胞培养上清中HBV DNA拷贝数随着TLR3蛋白表达量的升高而降低,从而说明TLR3在清除HBV感染与抑制HBV复制中起到重要作用。 ②HBV刺激能诱导BeWo细胞分泌细胞因子IL-10、TNF-α和IFN-β,PolyI:C刺激增强了BeWo细胞分泌细胞因子的能力,抑制TLR3质粒转染的BeWo细胞在HBV刺激下其细胞因子分泌能力下降,说明TLR3是通过诱导BeWo细胞分泌其相关信号转导途径的细胞因子而发挥抗HBV感染的能力。
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R512.62
【图文】：

图 1-3 正常组 BeWo 细胞培养 48h（10×10） 图 1-4 正常组 BeWo 细胞培养 96h（10×10）图 1-5 HBV 刺激组培养 8h（10×10） 图 1-6 HBV 刺激组培养 16h（10×10）

图 1-3 正常组 BeWo 细胞培养 48h（10×10） 图 1-4 正常组 BeWo 细胞培养 96h（10×10）图 1-5 HBV 刺激组培养 8h（10×10） 图 1-6 HBV 刺激组培养 16h（10×10）

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本文编号：2713341