谷氨酰胺对体外肠上皮细胞缺血再灌注损伤后紧密连接蛋白occludin表达的影响

发布时间：2020-06-16 01:05

【摘要】：目的：建立体外肠缺血再灌注损伤模型,检测谷氨酰胺对肠上皮细胞增殖活性及紧密连接蛋白occludin表达的影响,验证谷氨酰胺对肠粘膜屏障的保护作用,并探讨其作用机制。方法：选择Caco-2细胞,利用缺氧(90min)/复氧(30min)的方法,在体外建立肠缺血再灌注损伤的模型,然后加入含有不同浓度谷氨酰胺的培养液继续培养。于造模后Oh、24h、48h,利用MTT比色试验检测细胞增殖活性,同时利用RT-PCR、 Western blot和免疫荧光技术检测occludin蛋白的表达情况。结果： 1.利用Caco-2细胞,成功建立了体外肠缺血再灌注损伤模型。 2.造模完成后,立即检测细胞增殖活性及occludin蛋白表达的变化。 ①MTT比色试验检测结果显示,OD值明显下降,Caco-2细胞增殖活性明显降低(p0.01)。 ②RT-PCR结果显示,Caco-2细胞occludin蛋白mRNA相对含量明显降低(p0.05)。 ③Western blot结果显示,Caco-2细胞occludin蛋白的表达未发生明显变化(p0.05)。 ④免疫荧光结果显示,荧光亮度及分布无明显差异,在细胞间连接处都显现出沿膜分布的明亮的蜂窝状线性荧光。 3.造模后,加入含有不同浓度谷氨酰胺(Ommol/L,4mmol/L,8mmol/L,12mmol/L,16mmol/L)的细胞培养液继续培养,并在24h和48h这两个时间点,分别检测OD值的变化。与未加谷氨酰胺组相比,谷氨酰胺浓度为4mmol/L和8mmol/L组细胞OD值明显增大,细胞增殖活性明显上升(p0.05)。而谷氨酰胺浓度为12mmol/L和16mmol/L的两组,与谷氨酰胺浓度为8mmol/L组相比,OD值无明显变化,细胞增殖活性变化不大(p0.05),故将这两个浓度组排除。 4.造模后,向细胞培养液中加入含有不同浓度谷氨酰胺(Ommol/L,4mmol/L,8mmol/L)的细胞培养液继续培养,并在24h和48h这两个时间点进行实验。 ①RT-PCR结果显示,谷氨酰胺明显促进Caco-2细胞occludin蛋白mRNA相对表达量的增加(p0.05),且具有一定的浓度相关性和时间相关性。 ②Western blot结果显示,谷氨酰胺明显促进Caco-2细胞促进occludin蛋白表达上调(p0.05),且具有一定的浓度相关性和时间相关性。 ③免疫荧光结果显示,向细胞培养液中加入谷氨酰胺能够使Caco-2细胞occludin蛋白的荧光分布更加连续完整,荧光染色更强,且具有一定的浓度相关性和时间相关性。结论： 1.利用Caco-2细胞,在体外建立肠缺血再灌注损伤模型后,细胞增殖活性明显下降,occludin蛋白mRNA相对含量明显降低,但该蛋白表达未见明显变化。 2. Caco-2细胞缺血再灌注损伤后,谷氨酰胺能够促进肠上皮细胞的增殖,同时在基因和蛋白水平上上调紧密连接蛋白occludin的表达。
【学位授予单位】：滨州医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R574

【参考文献】