c-FLIP_L在肝纤维化形成与逆转过程中的表达及对TRAIL诱导HSC凋亡的调控作用研究

发布时间：2020-06-16 10:19

【摘要】：肝纤维化(hepatic fibrosis, HF)是肝脏对各种慢性刺激进行损伤修复反应时,以胶原为主的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)在肝内大量沉积的病理过程。肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)在肝纤维化形成过程中居核心地位。越来越多的研究表明,肝纤维化是可以自发逆转恢复的,而活化的HSC凋亡是其逆转的关键。肝纤维化逆转过程中,肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand, TRAIL)起了重要的凋亡诱导作用。前期研究发现,肝纤维化形成与逆转过程中大鼠枯否细胞(kupffer cell, KC)分泌TRAIL增加,HSC表达TRAIL死亡受体DR4、DR5也明显增加。这就提出了一个问题:肝纤维化逆转过程中,TRAIL及其死亡受体表达增加,HSC表现为凋亡;而肝纤维化形成过程中TRAIL及其死亡受体表达亦增加,HSC为何表现为增殖?细胞型Fas相关死亡域样白介素-1β转换酶抑制蛋白(c-FLIP),通过抑制Caspase-8,阻断死亡诱导信号复合物(DISC)的形成,调节TRAIL凋亡通路;鉴于c-FLIP在调节TRAIL凋亡通路中的重要作用,本研究拟选用CCl4诱导的肝纤维化自发逆转模型,研究c-FLIP在肝纤维化不同时期的表达及对TRAIL诱导的HSC凋亡的影响,并进一步探讨调控c-FLIP蛋白的信号通路以及来氟米特(leflunomide,Lef)促进HSC凋亡的作用机制。研究内容主要包括以下三个部分: 1.大鼠肝纤维化自发逆转模型的制备为探讨肝纤维化不同时期HSC对TRAIL凋亡敏感性的机制,我们利用CCl4诱导大鼠12周,自发逆转4周,建立肝纤维化自发逆转模型。结果显示:与肝纤维化模型组比较,逆转期大鼠ALT、AST明显降低,反应肝纤维化程度的血清学指标(HA,HA,LN,PCⅢ,CⅣ)和组织学指标组织羟脯氨酸含量(Hydroxyproline,Hyp)亦明显降低;病理组织学检测发现逆转期肝组织中胶原的含量明显下降,同时胶原纤维向组织内延伸的程度也明显降低;免疫组织化学检测HSC活化的标志α-SMA发现,逆转期肝组织中活化的HSC与模型组比较明显减少。以上结果提示肝纤维化逆转动物模型建立成功。 2. c-FLIPL在肝纤维化形成与逆转过程中的表达及对TRAIL诱导HSC凋亡的调控作用研究原位灌流提取大鼠肝纤维化不同时期HSC,以外源性TRAIL诱导其凋亡,通过DNA ladder及流式细胞术检测发现,肝纤维化逆转期HSC凋亡率较模型组HSC明显增加,逆转期HSC中caspase-3活性明显高于模型组;检测肝组织及HSC中c-FLIPL表达发现,肝纤维化逆转期肝组织及HSC中c-FLIPL表达与模型组比较明显降低;通过siRNA干扰模型组c-FLIPL表达,则明显增加TRAIL诱导的HSC凋亡率;进一步研究发现,肝纤维化逆转期HSC中p-Akt、mTOR及p-p70S6K表达与模型组比较明显减少,利用磷酯酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinases, PI3K)抑制剂LY294002及雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)抑制剂雷帕霉素,可明显抑制c-FLIPL表达,增加HSC对TRAIL诱导凋亡的敏感性;利用siRNA抑制模型组核糖体40S小亚基S6K蛋白激酶(p70S6K)表达,亦可明显增加TRAIL诱导的HSC凋亡率。以上结果提示肝纤维化不同时期c-FLIPL表达的改变影响HSC对TRAIL诱导凋亡的敏感性,PI3K/Akt/mTOR/p70S6K信号途径,在肝纤维化形成过程中,通过增加c-FLIPL表达抑制了TRAIL诱导的HSC凋亡。 3.来氟米特促进TRAIL诱导的HSC-T6凋亡的机制研究 Lef为免疫调节剂,可促进TRAIL诱导的HSC凋亡,但其具体作用机制还不明确。研究发现:Lef预处理HSC-T6细胞,可显著抑制Leptin诱导活化的HSC-T6中c-FLIPL蛋白表达,呈剂量依赖性;并明显增加caspase-3的活性,同时活化的HSC-T6凋亡率亦明显增高;提示Lef可能通过抑制HSC-T6中c-FLIPL的表达,促进TRAIL诱导的HSC凋亡。进一步研究发现Lef预处理HSC-T6细胞可显著抑制Leptin诱导活化的HSC-T6中p-Akt、mTOR及p-p70S6K蛋白表达,促进HSC-T6的凋亡。以上实验结果提示,Lef可通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路,抑制c-FLIPL蛋白的表达,增加HSC对TRAIL诱导的凋亡敏感性。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R575.2
【图文】：

大鼠肝组织,胶原纤维,肝小叶

图 1 大鼠肝组织病理学检测(HE 染色×100)A：对照组大鼠肝组织；B：CCl4诱导 12 周大鼠肝组织；C：CCl4诱导 12 周后停药 4 周大肝组织Fig.1 Photomicrographs of liver sections stained with haematoxylin eosin (HE×100).A: Control; B: Model; C: 4w spontaneous recovery after injecting CCl412wMasson 染色：正常大鼠肝脏无明显胶原纤维增生(图 2A)；CCl4诱导 12 周大鼠的肝脏组织有大量纤维形成，汇管区明显增生，并向肝小叶内延伸，形成厚薄不一的纤维隔，分割包绕肝小叶，局部有假小叶形成(图 2B)；停止 CCl4诱导逆转 4 周大鼠组织中可见少量胶原纤维，形成间断的纤维间隔，无明显假小叶形成，与 CCl4导 12 周大鼠的肝脏组织相比，其肝组织胶原纤维增生明显减少(图 2C) (表 1)。

大鼠肝组织,胶原纤维,肝小叶

图 1 大鼠肝组织病理学检测(HE 染色×100)A：对照组大鼠肝组织；B：CCl4诱导 12 周大鼠肝组织；C：CCl4诱导 12 周后停药 4 周大鼠肝组织Fig.1 Photomicrographs of liver sections stained with haematoxylin eosin (HE×100).A: Control; B: Model; C: 4w spontaneous recovery after injecting CCl412wMasson 染色：正常大鼠肝脏无明显胶原纤维增生(图 2A)；CCl4诱导 12 周大鼠的肝脏组织中有大量纤维形成，汇管区明显增生，并向肝小叶内延伸，形成厚薄不一的纤维间隔，分割包绕肝小叶，局部有假小叶形成(图 2B)；停止 CCl4诱导逆转 4 周大鼠肝组织中可见少量胶原纤维，形成间断的纤维间隔，无明显假小叶形成，与 CCl4诱导 12 周大鼠的肝脏组织相比，其肝组织胶原纤维增生明显减少(图 2C) (表 1)。A B C

【参考文献】