乙型肝炎病毒X蛋白对HBV复制相关微染色体重塑的影响

发布时间：2020-06-16 22:04

【摘要】：背景和目的:染色质样结构的病毒微染色体由组蛋白、非组蛋白和乙型肝炎病毒（HBV）共价闭合环状DNA（cccDNA）一起共同组装而成。微染色体重塑在HBV复制中起关键作用，而HBV复制依赖于乙肝病毒X蛋白（HBx）的存在。本研究将进一步明确HBx除了调控cccDNA招募的组蛋白H3乙酰化修饰以外，是否还调控HBV复制相关的其他微染色体重塑。 方法:运用定点突变技术构建HBx缺失突变型质粒，用SapI酶单酶切野生型HBV全长基因组的质粒和HBx缺失突变型质粒，将获得的线性野生型和HBx缺失突变型HBV基因组DNA分别瞬时转染至HepG2细胞，研究HBx对病毒复制、转录、病毒抗原分泌以及cccDNA招募的组蛋白H3甲基化、磷酸化和乙酰化修饰的调控作用。 结果: HBx缺失虽然不影响cccDNA的合成，但是它能导致HBV复制、转录和抗原分泌都显著减少。cccDNA招募的组蛋白H3乙酰化、单甲基化和磷酸化都与HBV复制密切相关，而且在HBx突变组中cccDNA招募的组蛋白H3单甲基化、磷酸化和乙酰化修饰水平都比野生组的水平显著降低。在HepG2细胞中HBx不仅调控HBV复制相关的cccDNA招募的组蛋白H3乙酰化修饰，而且调控cccDNA招募的组蛋白H3甲基化和磷酸化修饰。 结论: HBx对HBV复制相关的微染色体重塑有重要调控作用。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R512.62
【图文】：

2 结果2.1 HBx 缺失突变质粒pUC-HBV1.0.X7 的鉴定以 pUC-HBV1.0 为模板进行 PCR 定点突变，PCR 突变产物经 1%琼脂糖电泳后见 5800 bp 的条带（带缺刻的开环的 HBx 缺失突变质粒），符合预期结果(图 1A)突变产物经 DpnI酶消化模板质粒后转化到感受态大肠杆菌 DH 5α，随机挑起 4 个白色菌落。用 HindIII 和 SacI 酶双酶切抽提的质粒，其酶切产物经1% 的琼脂糖电泳后3200 bp HBx 缺失突变型 HBVDNA 片段和2600 bp pUC19 载体片段（图 1B）。酶切结果正确的质粒送大连宝生物公司 DNA 测序，测序结果示 HBx 读码框中第 7 位氨基酸引入终止密码，即将第 8 位谷氨酰胺 Gln 的密码子 CAA 突变为终止密码TAA，也与预期结果相符（图 1C）。这表明 HBx 缺失突变质粒 pUC-HBV1.0.X7 构建成功。

重庆医科大学硕士研究生学位论文.2 野生型和 HBx 缺失突变型 HBV 细胞复制模型的构建.2.1 线性 HBV DNA 的获得用 SapI 单 酶 切 野 生 型 质 粒 pUC-HBV1.0 和 HBx 缺 UC-HBV1.0.X7，其酶切产物经1%的琼脂糖电泳后见3200 bp HBV DNAUC19 载体片段（图2A）,切下 3200 bp 条带的凝胶，经胶回收纯化脂糖电泳后只见3200 bpHBVDNA 片段（图2B）。

【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 周赞虎;张永祥;陈枝华;刘仁海;田蕴;郑天凌;;基因改造中快速PCR定点突变方法应用[J];中国公共卫生;2007年01期

本文编号：2716652